張艷，楊怡，金心（國藥葛洲壩中心醫(yī)院＆三峽大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科，湖北宜昌 443002）

纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)ib）是一種由肝細(xì)胞合成［1］的具有凝血功能的蛋白質(zhì)，是纖維蛋白的前體。Fib具有雙重生物活性，既是凝血酶作用的底物，又是高濃度纖溶酶的靶物質(zhì)，其主要生理功能是進(jìn)入血液循環(huán)后參與凝血和調(diào)節(jié)纖溶［2］，與應(yīng)激反應(yīng)、動脈血栓形成、彌漫性血管內(nèi)凝血等密切相關(guān)［3］。目前，F(xiàn)ib 的檢測方法主要有馮·克勞斯（Von Clauss）法及凝血酶原時(shí)間衍生法（prothrombin time-derived，PT-der法）2 種［4］。Von Clauss法是WHO推薦的參考方法［5］，也是美國國家臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會推薦的Fib 常規(guī)測定方法［6］。Fib 因基因多態(tài)性［7］而具有高度異質(zhì)性，其檢測受較多因素影響。文獻(xiàn)報(bào)道［8］在沒有異常Fib 存在的情況下，PT-der法檢測結(jié)果在2.00～4.00 g／L 時(shí)可替代Von Clauss 法。但在驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn)，幾乎所有PT-der 法檢測Fib 的結(jié)果均比Von Clauss 法高10%～20%。在查閱資料后推測，2 種方法檢測結(jié)果誤差的原因可能是使用了同一校準(zhǔn)品但賦值不同。本研究擬用量值傳遞的方法校準(zhǔn)PT-der法，即以可溯源的Von Clauss 法賦值混合血漿對PT-der法進(jìn)行重新定標(biāo)，再用大量臨床樣本確立其與Von Clauss法檢測結(jié)果的一致性區(qū)間和適用范圍。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 沃芬TOP 700和TOP 300 全自動凝血分析儀及其配套試劑（Von Clauss法試劑批號N0688281，PT-der法試劑批號N0386789）、校準(zhǔn)品（批號E0177755）和雙水平質(zhì)控品（批號N0386250和H0864436）。校準(zhǔn)品中Fib 可溯源至英國國家生物制品檢定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）。

1.2 樣本

1.2.1 標(biāo)本來源 國藥葛洲壩中心醫(yī)院2018年11月至2019年4月住院及門診檢測凝血項(xiàng)目的患者5 142例，年齡2～95 歲（中位年齡52 歲），其中男2 619例，女2 523例。采集清晨空腹靜脈血1.8 mL于真空凝血采血管（含0.2 mL 0.109 mmol／L 枸櫞酸鈉抗凝劑）中，以離心力2 000×g離心15 min，剔除黃疸、溶血、脂血標(biāo)本及重度貧血患者標(biāo)本。

1.2.2 混合血漿制備 用30 份新鮮血漿按低值、正常和高值以4 ∶23 ∶3 的比例等量混合（基于本院近2年約50 000份臨床樣本結(jié)果分布所得）。

1.3 PT-der法校準(zhǔn)

1.3.1 混合血漿賦值 用Von Clauss 法連續(xù)檢測混合血漿Fib 20次，計(jì)算其剔除離群值（超3 倍標(biāo)準(zhǔn)差）后的均值，以此均值作為該混合血漿的賦值。

1.3.2 校準(zhǔn) 用已賦值的混合血漿作為校準(zhǔn)品依照原廠校準(zhǔn)方法（六點(diǎn)擬合直線）校準(zhǔn)PT-der法。

1.4 性能驗(yàn)證

1.4.1 精密度驗(yàn)證 參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP15-A文件［9］推薦方法進(jìn)行。選擇正常和異常2個(gè)濃度水平的質(zhì)控品，用PT-der法測定Fib。先將各濃度水平取1支復(fù)溶，再分裝成5 份，冷藏，每天取出各1份復(fù)溫后在1批中檢測，每批每個(gè)水平重復(fù)測定3次，每個(gè)項(xiàng)目連續(xù)測定5 d，將所測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算批內(nèi)精密度、批間精密度、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（s1）、自由度（T）和驗(yàn)證值（V）。當(dāng)s1＜V時(shí)認(rèn)為廠家聲明的精密度通過驗(yàn)證。

1.4.2 線性范圍驗(yàn)證 參照CLSI EP6-A文件［10］，選擇低值（L）和高值（H）樣品各1 份，將低值和高值樣本按4 ∶0、3 ∶1、2 ∶2、1 ∶3、0 ∶4 的比例混合，得到5份線性試驗(yàn)樣本。對上述樣本重復(fù)測定3 次，取平均值。各樣本濃度的預(yù)期值按公式（CL×VL＋CH×VL）／（VL＋VH）計(jì)算（式中C 為樣本濃度，V 為樣本體積）。將實(shí)測平均值與預(yù)期值先進(jìn)行數(shù)據(jù)檢查，剔除離群值，再用多元線性回歸分析，并繪制散點(diǎn)圖進(jìn)行評價(jià)。

1.4.3 重新制定本區(qū)域人群的參考區(qū)間 參照WS／T 402—2012《臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)項(xiàng)目參考區(qū)間的制定》［11］，選取不低于120 例表觀健康體檢者（排除妊娠、糖尿病、血栓類疾病、腎病、免疫系統(tǒng)疾病、血液病、肝臟疾?。杉崭箍鼓肰on Clauss法和PT-der法檢測Fib，分別取總體結(jié)果的95%置信區(qū)間（P2.5～P97.5）為本區(qū)域人群參考區(qū)間。

1.5 樣本檢測 在室內(nèi)質(zhì)控檢測結(jié)果在控的情況下，在TOP700 和TOP300 上同時(shí)用Von Clauss 法及PT-der法檢測血漿樣本Fib，采集樣本2 h 內(nèi)完成檢測。各項(xiàng)操作嚴(yán)格按照儀器、試劑說明書及操作規(guī)程進(jìn)行。將PT-der 法檢測結(jié)果設(shè)為觀察組，Von Clauss法檢測結(jié)果設(shè)為參照組。

1.6 確立一致性區(qū)間及適用范圍 用2018 年11月至2019年4月本院凝血樣本分別用PT-der法與Von Clauss法檢測Fib。以Von Clauss法檢測為參照，確立PT-der法與Von Clauss法99%的結(jié)果符合WS／T 406—2012《臨床血液學(xué)檢驗(yàn)常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求》［12］中Fib 準(zhǔn)確度要求（偏倚≤20%）范圍內(nèi)的數(shù)值區(qū)間和適用范圍。偏倚以Von Clauss法檢測結(jié)果為比對標(biāo)準(zhǔn)；符合率為同一樣本用以Von Clauss法結(jié)果為靶值，PT-der 法檢測結(jié)果達(dá)到準(zhǔn)確度要求（偏倚≤20%）的比例。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel 2010 軟件進(jìn)行。計(jì)算ˉx、s、偏倚等，計(jì)量資料以表示，進(jìn)行線性回歸分析，擬合線性方程并計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r）。

2 結(jié)果

2.1 校準(zhǔn)前PT-der法與Von Clauss法Fib 檢測結(jié)果一致性分析 在用原廠校準(zhǔn)模式時(shí)，對PT-der法線性范圍（0.70～7.00 g／L）內(nèi)的855 例樣本結(jié)果進(jìn)行了比對，總計(jì)70.18%（600／855）的PT-der 法檢測結(jié)果符合WS／T 406—2012的準(zhǔn)確度要求，見表1。

表1 重新校準(zhǔn)前兩種Fib檢測結(jié)果的比較

2.2 校準(zhǔn)后PT-der法的性能驗(yàn)證

2.2.1 精密度驗(yàn)證結(jié)果s1（分別為0.081 和0.068）在正常和異常商業(yè)質(zhì)量控制參考水平下均小于V（分別為0.101和0.085），表明廠家聲明的精密度通過驗(yàn)證。

2.2.2 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果 PT-der 法檢測Fib 的預(yù)期值（y）與實(shí)測值（x）無明顯離群值，最佳擬合方程為二次多項(xiàng)式，回歸方程為y＝－0.006 2x2＋0.949 4x＋0.036 7，r2＝0.999 9，5個(gè)濃度梯度標(biāo)本的偏差為－0.58%～0.62%，平均偏差為－0.07%。以WS／T 406—2012 的偏倚（≤10%）為評判標(biāo)準(zhǔn)，PT-der法檢測Fib在0.70～7.01 g／L 范圍內(nèi)呈臨床可接受的三階線性，廠家聲明的0.70～7.00 g／L 線性范圍通過驗(yàn)證。

2.2.3 本區(qū)域人群的參考區(qū)間 127 例符合入選標(biāo)準(zhǔn)的體檢者，年齡23～73 歲（中位數(shù)為42 歲），其中男72 例，女55 例。用PT-der 法檢測Fib 結(jié)果為2.18～5.11 g／L（95%置信區(qū)間為2.29～5.02 g／L），用Von Clauss法檢測結(jié)果為2.25～5.07 g／L（95%置信區(qū)間為2.33～4.95 g／L），均無離群值。本實(shí)驗(yàn)室PT-der法、Von Clauss法檢測Fib 的參考區(qū)間分別為2.29～5.02 g／L、2.33～4.95 g／L。

2.3 校準(zhǔn)后的PT-der法與Von Clauss法Fib 檢測結(jié)果的一致性分析

2.3.1 樣本分布 2018 年11 月至2019 年4 月用2 種方法檢測Fib總計(jì)5 142例，其中Von Clauss法檢測結(jié)果異常1 199例，低于參考區(qū)間723例，高于參考區(qū)間476例。

2.3.2 適用條件 結(jié)果比對時(shí)發(fā)現(xiàn)，一些特殊情況（總計(jì)44份，占總樣本的0.86%）的檢測結(jié)果偏差較大，包括：（1）大量使用抗凝藥物后（如透析后）；（2）明確診斷肝硬化失代償期等影響凝血的疾??；（3）纖維蛋白降解產(chǎn)物（FDP）≥30 mg／L；（4）凝血酶時(shí)間（TT）≥25 s時(shí)；（5）活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）≥80 s。

2.3.3 PT-der法適用范圍的確定 排除上述異常樣本后，總計(jì)有5 098 份，年齡區(qū)間為2～93 歲，其中男2 596例，女2 502 例，PT-der法結(jié)果在1.51～7.00 g／L區(qū)間內(nèi)時(shí)4 995份樣品中4 981 份符合一致性要求（相對偏差≤20%），符合率為99.72%，見表2。

表2 重新校準(zhǔn)后2種Fib檢測結(jié)果的比較

2.4 實(shí)際應(yīng)用 結(jié)合以上研究和驗(yàn)證結(jié)果設(shè)立本實(shí)驗(yàn)室Fib 的檢測方案：2 臺TOP Family 系列凝血儀先分別用本研究方法進(jìn)行PT-der法校準(zhǔn)，再用2種方法同時(shí)檢測20 例以上樣品，如PT-der 法95%及以上樣品結(jié)果與Von Clauss 法結(jié)果的偏倚≤20%，則認(rèn)為校準(zhǔn)成功，反之重新校準(zhǔn)。校準(zhǔn)成功后日常所有Fib 的樣本均使用PT-der 法進(jìn)行初次檢測，（1）如結(jié)果在1.51～7.00 g／L 范圍內(nèi)且未出現(xiàn)2.3.2中不適用條件時(shí)，直接報(bào)告結(jié)果；（2）如出現(xiàn)2.3.2中不適用條件，手動使用Von Clauss 法復(fù)測Fib；（3）如結(jié)果不在1.51～7.00 g／L范圍內(nèi)則會自動使用（已設(shè)置好的復(fù)檢程序）Von Clauss 法復(fù)測Fib；（4）使用自建PT-der 法參考區(qū)間進(jìn)行臨床報(bào)告。在確立本方案后，本實(shí)驗(yàn)室半年中Fib 復(fù)測率僅為3.89%（418／10 975），如使用相關(guān)文獻(xiàn)［8］報(bào)道方案估算復(fù)測率為35.65%（3 913／10 975），大幅度的提高了檢測速度（PT、APTT、TT 和Fib 在TOP700聯(lián)合檢測可由原先的每小時(shí)60 例提升至每小時(shí)78例）和效率并減少了試劑開支。

3 討論

Fib是凝血狀態(tài)的重要標(biāo)志物［13］，近年來研究發(fā)現(xiàn)其水平過高易引起缺血性心臟病、心源性猝死等心血管疾?。?4］，其水平過低也會導(dǎo)致凝血過程中血凝塊形成質(zhì)量下降［15］，從而易引起出血性疾病。Von Clauss法目前是Fib 檢測的參考方法［5］；而PT-der法可在儀器測定凝血酶原時(shí)間（prothrombin time）時(shí)，通過Fib形成的纖維蛋白，根據(jù)纖維蛋白濁度推算出Fib的含量［16］，更為經(jīng)濟(jì)實(shí)用。有文獻(xiàn)報(bào)道［4，17］PT-der 法和Von Clauss 法在正常范圍內(nèi)的檢測結(jié)果較為接近，而在異常范圍內(nèi)則相差較大，也有學(xué)者認(rèn)為PT-der 法不是一種可靠的方法［5，17-18］。

本實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證2種方法檢測2.00～4.00 g／L濃度Fib的一致性時(shí)發(fā)現(xiàn)，PT-der 法檢測Fib 的結(jié)果幾乎均高于Von Clauss法10%～20%。查閱說明書后發(fā)現(xiàn)，上述2種方法使用同一校準(zhǔn)品但賦值卻不相同，所以推測賦值不同引起檢測結(jié)果不同。一項(xiàng)多中心研究指出PT-der 和Von Clauss方法之間的偏差取決于校準(zhǔn)曲線，且差異程度與校準(zhǔn)曲線和血漿樣品濁度有關(guān)［19］。而制造商提供的校準(zhǔn)品濁度較高，考慮到這兩方面因素，我們采用量值傳遞方式給新鮮清澈的混合血漿賦值，并以此重新校準(zhǔn)PT-der法［16］。所謂量值傳遞就是將國際（國家）計(jì)量基準(zhǔn)所復(fù)現(xiàn)的量值，通過檢定或校準(zhǔn)方式傳遞給下一級計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)，并依次傳遞到工作計(jì)量器具，以保證量值準(zhǔn)確一致［20］。本研究正是使用參考方法校準(zhǔn)常規(guī)（下一級）方法，完全依照量值傳遞方式進(jìn)行。因?yàn)閂on Clauss法具有完整溯源鏈，所以重新校準(zhǔn)的PT-der 法也可以沿著Von Clauss法溯源鏈一級一級追溯到NIBSC（原廠的溯源計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)）。

關(guān)于2種方法結(jié)果相關(guān)性的研究較多，但大多數(shù)只停留于結(jié)果比對階段，分析PT-der 法的結(jié)果是否準(zhǔn)確，但不同品牌、不同型號的血凝儀2 種方法的差異程度也不盡相同［4］。而本研究卻通過量值傳遞的方法重新校準(zhǔn)并驗(yàn)證了PT-der 法，并使用大量樣本的結(jié)果比對建立了PT-der 法的適用條件和范圍，使2種方法檢測結(jié)果在一定范圍內(nèi)可以互換。與此同時(shí)Rizzo等［21］也發(fā)現(xiàn)，不同方法檢測到的Fib水平的偏差與肝硬化的嚴(yán)重程度有關(guān)，與本研究結(jié)果一致，即在肝硬化失代償期，2 種方法的檢測值偏差可能超過20%。

值得注意的一點(diǎn)是，2 種方法原廠給出的參考區(qū)間并不完全相同，但所查閱到的文獻(xiàn)均未提及。因此，本研究對PT-der 法進(jìn)行了重新校準(zhǔn)，重新建立了本實(shí)驗(yàn)室的參考區(qū)間。在研究中，我們發(fā)現(xiàn)2種方法的一致性區(qū)間涵蓋了2種方法的參考區(qū)間，而PT-der法參考區(qū)間又涵蓋了Von Clauss法參考區(qū)間，加之實(shí)際應(yīng)用中幾乎所有一致性區(qū)間內(nèi)的結(jié)果均使用PT-der 法檢測，故可用PT-der 法參考區(qū)間進(jìn)行臨床報(bào)告。

需要指出，本研究僅使用本區(qū)域人群的檢測數(shù)據(jù)，基于本實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和試劑并制定檢測方案，不具有普遍適用性。不同實(shí)驗(yàn)室可借鑒此方法制定出適宜自己實(shí)驗(yàn)室的檢測方案，在保證檢驗(yàn)質(zhì)量前提下以最小的成本和最快的速度為臨床和廣大患者服務(wù)。