王彥云，程威，洪冬洋，孫云，蔣濤（南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院＆南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心，南京 210004）

氨甲酰磷酸合成酶、鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸琥珀酸裂解酶、精氨酸酶和鳥(niǎo)氨酸－δ－轉(zhuǎn)氨酶缺乏可導(dǎo)致先天性尿素循環(huán)障礙性疾病（urea cycle disorders，UCD）［1］。鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥（ornithine transcarbamylase deficiency，OTCD）是最常見(jiàn)的UCD，其發(fā)病率約為1／56 500［2］。氨甲酰磷酸合成酶缺乏癥（carbamoyl phosphate synthetase deficiency，CPSD）與OTCD 同屬于UCD。OTCD和CPSD 均表現(xiàn)為血漿氨、谷氨酰胺（Gln）增高，精氨酸（Arg）和瓜氨酸（Cit）降低［3］。CPSD與OTCD致死、致殘率較高，患兒血液中Cit可作為篩查指標(biāo)。2019年《新生兒疾病串聯(lián)質(zhì)譜篩查技術(shù)專(zhuān)家共識(shí)》［4］將OTCD和CPSD納入新生兒遺傳代謝病篩查病種。

電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（electrospray ionization-tandem mass spectrometry，ESI-MS／MS）技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)干血濾紙片樣品中的11 種氨基酸，分別為丙氨酸（Ala）、Arg、Cit、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、蛋氨酸（Met）、鳥(niǎo)氨酸（Orn）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）。國(guó)內(nèi)大部分新生兒篩查中心當(dāng)前均采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)干血斑中Cit濃度來(lái)篩查新生兒OTCD和CPSD，暫未見(jiàn)用ESI-MS／MS 技術(shù)檢測(cè)干血斑中Gln 和谷氨酸（Glu）［5］。在實(shí)際臨床應(yīng)用中，依賴(lài)Cit 濃度篩查OTCD和CPSD 的靈敏度不足50%且假陽(yáng)性率高［6］。本研究擬建立一種用ESI-MS／MS 技術(shù)檢測(cè)Gln和Glu的方法，該方法不影響常規(guī)臨床檢測(cè)、不額外消耗干血斑樣品量。本研究將該方法應(yīng)用于篩查新生兒OTCD 和CPSD，并初步制定本地區(qū)新生兒Gln 的參考區(qū)間，為OTCD 和CPSD 的新生兒篩查提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2020 年6—9月南京市新生兒遺傳代謝病篩查足跟血干血斑樣品。本研究獲得南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（文號(hào)：寧婦倫字［2018］93號(hào)），新生兒的監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與儀器 非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒（美國(guó) PE 公司）；甲醇（色譜級(jí)，貨號(hào)1060075000，德國(guó)默克公司）；XTQD 電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；8通道微量移液器（Thermo公司）；純水儀（杭州萬(wàn)潔公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本前處理 非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒內(nèi)含流動(dòng)相、萃取液、11種氨基酸內(nèi)標(biāo)、琥珀酰丙酮內(nèi)標(biāo)和13種?；鈮A內(nèi)標(biāo)。首先用該試劑盒進(jìn)行標(biāo)本前處理，然后進(jìn)行常規(guī)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，再用萃取液進(jìn)行復(fù)溶后用ESI-MS／MS 技術(shù)檢測(cè)Gln 和Glu。ESI-MS／MS技術(shù)檢測(cè)干血斑Gln 和Glu 的流程見(jiàn)圖1。

圖1 ESI-MS／MS技術(shù)檢測(cè)干血斑Gln和Glu的流程

將3 mm干血濾紙片（相當(dāng)于3.2 μL 全血）置于溫育用96孔U形板中，每孔加入100 μL萃取液和內(nèi)標(biāo)混合液，密封后45 ℃恒溫震蕩45 min，然后將上清液（約75 μL）轉(zhuǎn)移至檢測(cè)用96 孔V 形板中，鋁膜覆蓋，室溫靜置2.5 h，即可上樣進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，每份樣品進(jìn)樣量為15 μL。常規(guī)檢測(cè)流程結(jié)束后，每孔殘余樣品中加入60 μL 萃取液，鋁膜覆蓋，室溫震蕩10 s混勻后即可上樣檢測(cè)Gln和Glu。每份樣品進(jìn)樣量為30 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 采用XTQD 電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，采用正離子掃描模式，掃描時(shí)間為1.5 min，離子源溫度設(shè)定為150 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流速850 L／h，錐孔反吹氣50 L／h，Leu、Gln和Glu離子采集通道分別為135.1→89.1 m／z、147.1→84.2 m／z、148.02→84.02 m／z。

1.3.3 內(nèi)標(biāo)選擇 由于本研究直接使用殘余樣品溶液，不再另行添加Gln 和Glu 的內(nèi)標(biāo)，因此直接使用試劑盒中已經(jīng)預(yù)添加的內(nèi)標(biāo)。當(dāng)分析物沒(méi)有相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)時(shí)，可參考“內(nèi)標(biāo)物的峰應(yīng)盡可能接近待測(cè)物的峰”原則［4］，本研究選定Leu 內(nèi)標(biāo)d3-Leu為Gln和Glu的參考內(nèi)標(biāo)。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取1.845 mg Gln和1.839 mg Glu溶解于5 mL 純水中，制備成2.5 mmol／L 的混合工作液，加入適當(dāng)體積的全血，最終工作濃度分別是1 250、500、250、125、50 μmol／L。以待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的濃度比作為橫坐標(biāo)，待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的離子響應(yīng)強(qiáng)度比作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，要求R2不小于0.990。

1.4 方法學(xué)評(píng)價(jià) 非衍生化串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒可常規(guī)檢測(cè)11 種氨基酸，但只有9 種氨基酸有商品化質(zhì)控品，另外2種氨基酸均采用樣本均數(shù)法作為室內(nèi)質(zhì)控的補(bǔ)充［7］。因此，本研究也采用樣本均數(shù)法對(duì)復(fù)溶后樣品檢測(cè)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控。在室內(nèi)質(zhì)控在控的情況下評(píng)價(jià)方法學(xué)性能。

1.4.1 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取2份健康人的全血，以及加入50、125、250、500、1 250 μmol／L Gln 和Glu的全血，均按照上述方法測(cè)定，計(jì)算回收率?；厥章剩剑〒Q算后測(cè)定濃度－基礎(chǔ)濃度）／加樣濃度×100%，回收率可接受標(biāo)準(zhǔn)為70%～130%。

1.4.2 正確度 參考CLSI EP15-A2指南，檢測(cè)50、125、250、500、1 250 μmol／L干血斑樣品，計(jì)算檢測(cè)值與理論值的相對(duì)偏倚。偏倚＝（測(cè)定值－理論值）／理論值×100%，偏倚≤±30%為中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（CDC）室間質(zhì)控可接受水平。

1.4.3 精密度 參考CLSI EP15-A2指南，選高、低濃度水平樣品，分別測(cè)定20次，后續(xù)每批實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定2 個(gè)濃度樣品2 次，驗(yàn)證精密度性能，以變異系數(shù)（CV）表示，CV＜10%為可接受水平。

1.4.4 穩(wěn)定性 通過(guò)常規(guī)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)后剩余樣品中Gln 和Glu 的檢測(cè)，可以降低假陽(yáng)性率。但剩余樣品可能面臨殘留量偏少問(wèn)題，因此需用試劑盒自帶的萃取液進(jìn)行復(fù)溶后檢測(cè)。由于Gln 不穩(wěn)定，需明確未復(fù)溶樣品和復(fù)溶后樣品中Gln 的差異。采用2020年7 月連續(xù)編號(hào)的255 份樣品，完成常規(guī)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)后，立即檢測(cè)Gln和Glu，檢測(cè)完成后的樣品立即進(jìn)行復(fù)溶，每孔中直接加入60 μL萃取液，鋁箔膜密封覆蓋，室溫震蕩10 s混勻后進(jìn)樣。比較復(fù)溶前后樣品中Gln和Glu的穩(wěn)定性。

1.5 臨床初步應(yīng)用 檢測(cè)612 例復(fù)溶樣品的Gln和Glu，觀(guān)察檢測(cè)值的分布情況；確診OTCD陽(yáng)性樣本共計(jì)6例，其中3例為患兒陳舊性初篩干血斑樣品，另外3例是將患兒的凍存抗凝靜脈血溶解后滴于空白濾紙片上，制備成干血斑樣品后進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 見(jiàn)圖2、3。在50～1 250 μmol／L范圍內(nèi)，Gln標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y＝0.081 3X＋0.330 8，R2＝0.998 6；Glu 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為Y＝0.076 1X＋0.19，R2＝0.999 6。

圖2 ESI-MS／MS檢測(cè)Gln的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

圖3 ESI-MS／MS檢測(cè)Glu的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.2 回收率 50、125、250、500、1 250 μmol／L Gln的回收率分別為170.90%、107.24%、98.16%、98.01%、101.15%，Gln 在125～1 250 μmol／L濃度范圍內(nèi)回收率良好。50、125、250、500、1 250 μmol／L Glu的回收率分別為191.22%、129.18%、113.65%、103.87%、102.06%，Glu在250～1 250 μmol／L濃度范圍內(nèi)回收率良好。

2.3 正確度 50、125、250、500、1 250 μmol／L Gln的偏倚分別為56.16%、1.33%、4.80%、3.46%、0.56%，Gln在125～1 250 μmol／L濃度范圍內(nèi)正確度良好。50、125、250、500、1 250 μmol／L Glu 的偏倚分別為37.45%、7.67%、2.90%、1.50%、0.09%，Glu在125～1 250 μmol／L濃度范圍內(nèi)正確度良好。

2.4 精密度 見(jiàn)表1。Gln精密度良好。

表1 Gln和Glu測(cè)定的重復(fù)性和期間不精密度

2.5 復(fù)溶樣品的穩(wěn)定性 用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析255例樣品復(fù)溶前、后Gln、Glu檢測(cè)結(jié)果，P值分別為0.148、0.000，表明可用復(fù)溶樣品檢測(cè)Gln。

2.6 臨床初步應(yīng)用 檢測(cè)612例復(fù)溶樣品的Gln和Glu，測(cè)定值呈偏態(tài)分布，鑒于在OTCD和CPSD患兒中，Gln均表現(xiàn)為增高，因此偏態(tài)分布數(shù)據(jù)單側(cè)參考區(qū)間取P95參考限，Gln參考區(qū)間為＜106.63 μmol／L，Glu參考區(qū)間為＜188.24 μmol／L。

表2中，樣品1～3是將低溫保存的陽(yáng)性靜脈血樣品復(fù)溶，顛倒混勻后直接滴于空白濾紙片，制備成干血斑后檢測(cè)，Gln 明顯增高，Glu 在參考區(qū)間內(nèi)；樣品4～6均為－20 ℃保存的陳舊性、陽(yáng)性干血斑樣品，檢測(cè)結(jié)果中Gln 未見(jiàn)明顯增高，但Glu 均明顯增高。

表2 OTCD陽(yáng)性樣品Gln和Glu檢測(cè)結(jié)果

3 討論

目前國(guó)內(nèi)暫未發(fā)布針對(duì)尿素循環(huán)障礙的專(zhuān)家共識(shí)。根據(jù)國(guó)外2002年尿素循環(huán)障礙的指南［8］以及2012年［3］、2019 年［9］專(zhuān)家共識(shí)，Gln 篩查OTCD和CPSD的特異性、敏感性高于Cit。但國(guó)內(nèi)一些針對(duì)OTCD、CPSD 的案例報(bào)道中，描述為Glu 增高。因此，本研究除了檢測(cè)Gln，還同步檢測(cè)干血斑中Glu。

根據(jù)OTCD 陽(yáng)性新鮮干血斑樣品與陳舊干血斑樣品對(duì)比結(jié)果，新鮮樣品中Gln 升高，Glu 正常，與國(guó)外指南描述一致；而陳舊性樣品中Glu 升高，Gln正常。結(jié)合文獻(xiàn)分析，Gln穩(wěn)定性比Glu弱，Gln的分解又稱(chēng)谷氨酰胺異化或谷氨酰胺降解，是通過(guò)一系列的生化反應(yīng)過(guò)程，將Gln降解為Glu、天門(mén)冬氨酸、二氧化碳、丙酮酸、乳酸、丙氨酸、檸檬酸等產(chǎn)物。因此，陳舊樣品中大量的Gln降解為Glu，導(dǎo)致了Glu異常增高；提示在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)同時(shí)檢測(cè)Gln、Glu，避免因干血斑樣品保存不當(dāng)而導(dǎo)致Gln表現(xiàn)為假陰性，同步檢測(cè)Glu可防止漏檢。

采用完成常規(guī)質(zhì)譜檢測(cè)后的干血斑樣品進(jìn)行復(fù)溶，在復(fù)溶樣品中檢測(cè)Gln 與Glu 還存在以下優(yōu)勢(shì)：（1）節(jié)約干血斑樣品量和縮短檢測(cè)時(shí)間。所有新篩樣品均必須進(jìn)行常規(guī)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)，用一次實(shí)驗(yàn)的成本已經(jīng)同步將Gln 和Glu 成功從干血斑中萃取出來(lái)，后續(xù)只需要用微量且極低成本的萃取液復(fù)溶后即可進(jìn)樣檢測(cè)。采用剩余溶液復(fù)溶后立即檢測(cè)Gln，可以在不增加干血斑樣本量和試劑成本的前提下迅速完成Cit 的二級(jí)篩查；（2）降低假陽(yáng)性率、提高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。常規(guī)臨床篩查工作中，以Cit低于6.0 或Cit／Phe 低于0.1 為界限統(tǒng)計(jì)，初次篩查陽(yáng)性率接近1／100，實(shí)際工作中OTCD與CPSD的發(fā)病率遠(yuǎn)低于該界限，過(guò)高的陽(yáng)性率會(huì)加重新生兒家屬的心理負(fù)擔(dān)并增加實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)成本，因此通過(guò)原始樣品檢測(cè)殘留物進(jìn)行二級(jí)篩查，可以降低假陽(yáng)性率、提高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和降低檢測(cè)成本。

本研究中雖然已經(jīng)初步建立Gln 和Glu 的參考區(qū)間，鑒于當(dāng)前陽(yáng)性樣本例數(shù)過(guò)少，后續(xù)工作中仍需積累陽(yáng)性樣本，進(jìn)一步評(píng)估該方法的性能。