郝一憲 李土玲 魏慧霞 劉金鵬 郭大東 畢宏生

流行病學調(diào)查研究顯示，近視在東亞和東南亞地區(qū)人群中普遍高發(fā)，其中青少年近視患病率為80%～90%，且高度近視患病率較高，為10%～20%，預計到2050年，全球近視人口將增加至50億[1-2]。近年來，調(diào)節(jié)在近視發(fā)病機制中的作用越來越受到人們的重視。有研究表明，持續(xù)近距離工作對睫狀肌造成的長期壓力可能會引起兒童近視眼的發(fā)生[3]。還有研究指出，由于異常自主神經(jīng)輸入導致異常的調(diào)節(jié)反應，睫狀肌可能參與了近視的發(fā)生、發(fā)展[4]。因此，作為調(diào)節(jié)反應的關鍵組織之一，睫狀肌在近視的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，但具體機制尚未完全清楚。作為一種平滑肌，睫狀肌由肌纖維束組成，肌束間結締組織中可見Ⅲ型膠原[5]，而且，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)以及金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)在睫狀肌組織中均有表達。上述蛋白成分的變化不僅影響細胞外基質(zhì)(ECM)的更新和重塑，而且影響睫狀肌的形態(tài)和功能變化。因此，睫狀肌中上述蛋白成分的異常表達可能與近視的發(fā)生、發(fā)展有關。本研究旨在探討MMP-3、TIMP-3和III型膠原α1(Col3α1)在透鏡誘導型近視豚鼠睫狀肌中的表達變化，同時觀察電針干預對其表達的影響，初步揭示睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表達變化在近視發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑YZ24帶狀光檢影鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)；眼科A型超聲儀(法國 Quantel Medical 公司)；針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，華佗牌)；電子診療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，華佗牌SDZ-Ⅴ型)；熒光顯微鏡(日本尼康)；Light Cycler?480Ⅱ實時熒光定量PCR儀 (Roche公司)；Elx800 酶標儀(美國 BioTek)；10 g·L-1鹽酸環(huán)噴托酯滴眼液(賽飛杰，美國艾爾康公司)；4 g·L-1鹽酸奧布卡因(倍諾喜，日本參天制藥株式會社)；改良組織/細胞 RNA 快速提取試劑盒(山東思科捷科學儀器有限公司)；HiScript?ⅡQ RT SuperMix qPCR(+gDNA wiper)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(增強型，碧云天生物技術有限公司)；MMP-3 、TIMP-3、Col3α1 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)。

1.1.2 實驗動物與分組2周齡英國種三色短毛健康雄性豚鼠90只(丹陽市呂城鎮(zhèn)奧臣實驗動物養(yǎng)殖場)，體重(110±10)g，入組前對豚鼠眼部進行篩選檢查，排除各種眼部疾患。隨后采用隨機數(shù)字表法將豚鼠分為正常對照(NC)組、透鏡誘導型近視(LIM)組以及LIM+電針干預(LIM+EA)組，每組各30只。各組豚鼠均在飼養(yǎng)1周、2周和4周時給予相應的處理。其中，NC 組豚鼠不作任何干預，LIM組和LIM+EA組豚鼠右眼均配戴-6.00 D透鏡作為造模眼，左眼不戴鏡作為自身對照；LIM+EA組豚鼠在戴鏡的同時給予電針刺激兩側太陽穴與合谷穴，每日上午900～1000電針干預30 min，波形為連續(xù)波，頻率2 Hz，脈沖長度0.1 s。實驗過程中保持飼養(yǎng)溫度 20～26 ℃，自然照明環(huán)境下12 h/12 h 晝夜循環(huán)，并供給自由飲食。本研究經(jīng)山東中醫(yī)藥大學附屬眼科醫(yī)院倫理委員會批準，并嚴格遵守視覺與眼科動物研究協(xié)會(ARVO)原則。

1.2 方法

1.2.1 各組豚鼠屈光度測量各組豚鼠于造模后 1周、2周和4周均進行屈光參數(shù)(近視屈光度)檢查。檢查前使用鹽酸環(huán)噴托酯滴眼液滴入結膜囊內(nèi)，共3次，每次 1滴，間隔5 min，滴眼30～45 min后進行屈光度檢查，每眼至少測3次，并取其平均值作為實驗結果。

1.2.2 各組豚鼠眼軸長度測量各組豚鼠于造模后1周、2周和4周均應用眼科A型超聲儀進行眼軸長度測量，測量前用鹽酸奧布卡因滴眼2次，每次1滴。儀器參數(shù)設置參考Zhou等[6]所述參數(shù):前房傳播速度為1557 m·s-1，晶狀體傳播速度為1723 m·s-1，玻璃體傳播速度為1540 m·s-1。測量前首先將探頭用酒精棉片擦拭消毒，然后將探頭垂直輕觸于角膜頂點處，連續(xù)測量10次，剔除偏大偏小誤差值后取平均值，整個過程中由同一位可熟練操作的視光師完成。

1.2.3 各組豚鼠行組織病理學染色觀察睫狀肌形態(tài)各組豚鼠造模后1周、2周和4周分別隨機取3只豚鼠，100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉處死，摘取每只豚鼠造模眼在無菌生理鹽水中進行簡單沖洗并剔除眼周組織，立即置于眼球固定液中固定24 h，然后進行常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，觀察每只豚鼠造模眼睫狀肌的生理形態(tài)結構變化。

1.2.4 q-PCR檢測各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA表達造模后1周、2周和4周，各組隨機選取3只豚鼠腹腔過量注射100 g·L-1水合氯醛麻醉處死，迅速摘取造模眼眼球，解剖分離出睫狀肌，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。選用改良組織/細胞RNA快速提取試劑盒提取睫狀肌組織總RNA，然后進行逆轉錄合成cDNA，采用q-PCR檢測各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA表達。應用DNAStar軟件進行各基因引物序列的設計，其中MMP-3上游引物:5’-CTGGGCCTGGGATTAATGGAGACG-3’，下游引物:5’-CAGCAGGAGAGGCAGGAGGAGGAC-3’，大小為255 bp；TIMP-3上游引物:5’-GCATCCGGCAGAAGGGTGGCTACT-3’，下游引物:5’-AGGGGTCTGTGGCGTTGATGA-3’，大小為84 bp；Col3α1上游引物:5’-GACCCCAAGGCCCCAAAGGAGAT-3’，下游引物:5’-AGGGGCACCAGGATGACCAGACG-3’，大小為272 bp；GAPDH 作為內(nèi)參基因，上游引物:5’-CTGACCTGCCGCCTGGAGAAACC-3’，下游引物:5’-ATGCCAGCCCCAGCGTCAAAAGT-3’，大小為170 bp。采用2-△△Ct方法對各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 的mRNA相對表達量進行定量分析。

1.2.5 ELISA法檢測各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表達造模后1周、2周和4周，各組隨機選取4只豚鼠并分離其造模眼睫狀肌組織，按質(zhì)量體積比(10 mg100 μL)加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA緩沖裂解液，電動勻漿充分研磨，5000 r·min-1離心5 min，取上清進行超聲破碎，5000 r·min-1離心5 min后取上清，用BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)測定各組豚鼠睫狀肌組織溶液中的總蛋白濃度，應用ELISA試劑盒檢測MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 各組豚鼠屈光度和眼軸長度變化造模后1周、2周和4周，與NC組相比，LIM組豚鼠造模眼與自身對照眼近視屈光度和眼軸長度的差值均顯著增加(均為P<0.001)；與LIM組相比，LIM+EA組豚鼠造模眼與自身對照眼近視屈光度和眼軸長度的差值均減小(均為P<0.05)(見表1)。

表1 造模后1周、2周、4周各組豚鼠屈光度和眼軸長度比較

2.2 各組豚鼠睫狀肌HE染色結果各組豚鼠睫狀肌HE染色結果顯示，NC組豚鼠睫狀肌纖維排列

緊密，均勻有序；LIM組豚鼠睫狀肌纖維排列松散混亂，有機纖維溶解斷裂；LIM+EA組豚鼠睫狀肌纖維排列較LIM組更為有序，相對完整。另外，隨著造模時間推移，LIM組豚鼠睫狀肌纖維排列愈加松散，斷裂溶解更加明顯；LIM+EA組豚鼠睫狀肌纖維排列雖仍然紊亂，但與LIM組相比，睫狀肌纖維排列紊亂情況有明顯改善(見圖1)。

圖1 造模后1周、2周和4周各組豚鼠睫狀肌HE染色結果

2.3 各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA表達造模后1周和2周，LIM組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA 的相對表達水平與 NC組相比均明顯升高(均為P<0.01)，LIM+EA組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA的相對表達水平與LIM組相比均降低(均為P<0.05)。造模后4周，LIM組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA的相對表達水平與 NC組相比均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，LIM+EA組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA的相對表達水平與LIM組相比均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表2)。

表2 造模后1周、2周和4周各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA相對表達水平

2.4 各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表達造模后1周和2周，LIM 組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白相對表達水平與NC組相比均明顯升高(均為P<0.05)，LIM+EA組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白相對表達水平與LIM組相比均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。造模后4周，LIM組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 的蛋白表達相對水平與 NC組相比均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，LIM+EA組豚鼠造模眼睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表達水平與LIM組相比均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)(見表3)。

表3 造模后1周、2周和4周各組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的蛋白表達

3 討論

有證據(jù)表明，近視的發(fā)生率與近距離工作和閱讀行為有關[7]。Vasudevan等[8]研究發(fā)現(xiàn)，早發(fā)性近視和晚發(fā)性近視比正視眼更容易產(chǎn)生因近距離工作誘發(fā)的短暫性近視，且長時間近距離工作可造成睫狀肌的持續(xù)收縮引起調(diào)節(jié)痙攣[9]。此外，近視兒童的睫狀肌體積大于非近視兒童，表明睫狀肌可能參與了屈光不正的發(fā)展[10]。本實驗所使用的透鏡誘導型近視豚鼠不僅可模擬人眼在近距離工作中近視的發(fā)生發(fā)展，為探討近視發(fā)生發(fā)展中睫狀肌ECM中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的異常變化提供良好的模型支撐，而且可為臨床應用電針干預防治近視作用機制提供一定的理論依據(jù)。

MMP主要參與細胞增殖、遷移和分化，ECM重塑以及組織浸潤和血管形成。TIMP作為一種內(nèi)源性組織抑制劑可以調(diào)節(jié)MMP的表達，并且MMP/TIMP比值通常決定ECM蛋白降解和組織重塑的程度[11]。組織重塑主要涉及ECM的合成和降解，其中MMP-3可降解ECM的各種蛋白多糖成分以及纖連蛋白、層粘連蛋白和明膠[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3的活性可能主要受TIMP-3高活性的抑制[14]。因此，TIMP-3作為MMP-3的抑制劑，其表達水平應與MMP-3成反比。Col3α1主要參與細胞黏附、遷移、增殖和分化，且在許多纖維化疾病，如腎纖維化、肝纖維化和系統(tǒng)性硬化癥中，其含量增加，形成更纖細的原纖維[15]。在本研究中，造模后1周和2周LIM組和LIM+EA組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表達均上調(diào)，與Jia等[16]研究結果相一致，即在近視(屈光度<-6.00 D)穩(wěn)定期患者的眼球標本房水中MMP-3和TIMP-3水平升高。根據(jù)動態(tài)平衡假說，TIMP表達水平的升高反映了一種細胞代償反應，即為抵消和限制因MMP水平升高引起ECM的強烈降解致使TIMP的表達代償性增加[17]。因此，本研究中TIMP-3表達量增加可能是對近視豚鼠睫狀肌異常變化的代償性反應。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，造模后1周和2周，LIM+EA組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表達均低于LIM組，提示電針干預近視豚鼠可影響睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表達，從而延緩近視的發(fā)生、發(fā)展。上述結果提示，在近視的發(fā)生發(fā)展中，MMP-3、TIMP-3和Col3α1的異常表達可能改變了睫狀肌的形態(tài)結構，進而影響睫狀肌的生理功能。

纖維化主要表現(xiàn)為損傷部位的成纖維細胞遷移、增殖以及ECM(包括膠原I、II、III、IV等)的沉積，常見于各種器官，包括心臟、肝、肺和腎臟[18]。纖維化主要包括四個階段，其中前3個階段分別為原發(fā)性組織損傷(第一階段)、激活效應細胞(第二階段)和產(chǎn)生ECM (第三階段)，在第四階段中，ECM的動態(tài)沉積和清除不充分導致纖維化增加，最終導致器官功能衰竭[19]。在某些病理因素的影響下，眼內(nèi)組織也可發(fā)生纖維化病變，如角膜纖維化、結膜纖維化、視網(wǎng)膜纖維化和鞏膜纖維化[20-22]。有研究結果表明，在纖維化動物模型中，其建立的纖維化可能會消退，可能與存在去除ECM沉積的內(nèi)源性機制有關[23]。還有研究表明，MMP-3、TIMP-3和Col3α1等細胞因子參與了肺纖維化及肝纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展[24-26]。在近視的發(fā)展過程中，ECM的丟失可能導致鞏膜重塑和眼軸增長[27]。本研究結果顯示，造模后4周LIM組近視豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1 mRNA和蛋白的相對表達水平均明顯下調(diào)且低于NC組，因此推測隨著近視度數(shù)的增加，睫狀肌形態(tài)結構發(fā)生病變，效應細胞活性下降，細胞合成細胞因子的功能受阻，相關細胞因子表達水平相應降低，進而導致睫狀肌正常的調(diào)節(jié)功能受阻，并逐漸導致睫狀肌功能受到抑制；而造模后4周，LIM+EA組豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的mRNA和蛋白的相對表達水平均高于LIM組，推測電針干預可恢復受損的睫狀肌細胞的生理功能，促進相關細胞因子的表達，進而改善睫狀肌組織的局部微環(huán)境，并影響睫狀肌組織的重塑過程，從而延緩近視的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，睫狀肌形態(tài)與功能的異常變化可影響近視的發(fā)生、發(fā)展，在近視發(fā)展初期，透鏡誘導型近視豚鼠睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1表達水平的上調(diào)可能導致睫狀肌發(fā)生纖維化病變，致使睫狀肌組織發(fā)生不同程度的重塑；電針干預可使透鏡誘導型近視豚鼠近視屈光度和眼軸長度增長減緩，且顯著下調(diào)睫狀肌中MMP-3、TIMP-3和Col3α1的表達，影響睫狀肌組織的重塑過程，從而在近視治療中發(fā)揮一定的作用。但電針干預治療近視的具體作用機制尚不明了，還需進一步研究及探索。