孫宇潔，付書璠，趙永璐，李 慧，黃 莉

安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院（合肥 230038）

黃芩（scutellaria baicalensis），又名空心草、黃金茶，唇形科植物。黃芩的根，《藥性論》載其：“能治熱毒骨蒸……去關(guān)節(jié)煩悶”。黃芩性寒味苦，歸肺、心、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芩的主要活性成分為黃酮及其苷類、萜類化合物及揮發(fā)油等，具有抗炎、解熱、殺滅微生物、抑制腫瘤生長等作用，對消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多系統(tǒng)的疾病均具有治療作用[1]。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種發(fā)病機制十分復(fù)雜的滑膜關(guān)節(jié)自身免疫病，典型臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥和關(guān)節(jié)外血管翳的形成，進一步可累及關(guān)節(jié)軟骨和骨，最終可致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[2]。由于RA的發(fā)病機制目前尚未明確，治療原則主要是通過延緩疾病進展和降低風(fēng)濕活動性來減少關(guān)節(jié)損傷和預(yù)防長期殘疾，并無規(guī)范的治療方案。臨床主要采用非甾體抗炎藥、地塞米松、甲氨蝶呤等，然而這些藥物長期服用會引起胃、肝、腎等多個臟腑功能的不良反應(yīng)，對機體傷害較大[3]。因此，開發(fā)高療效、低副作用、低毒性的新型RA 藥物具有重要的臨床應(yīng)用價值。中藥在治療RA方面的優(yōu)勢亟待開發(fā)，具有廣闊的研究前景。本文旨在運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)初步探究黃芩治療RA的生物學(xué)過程，從靶點、信號通路的角度揭示其治療機制，為實驗研究及未來臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點的篩選

通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）檢索黃芩的化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18作為篩選條件，時間截止至2020年4月10日，篩選出活性成分較高的化合物，同時利用此平臺下載相關(guān)有效成分對應(yīng)的蛋白作用靶點。

1.2 RA相關(guān)靶點的篩選

將“rheumatoid arthritis”作為關(guān)鍵詞，對GeenCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）進行檢索，將兩個數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果合并后去除重復(fù)后作為疾病靶點數(shù)據(jù)庫備用。

1.3 黃芩-RA靶點網(wǎng)絡(luò)的建立及可視化

利用Venn 在線軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）將藥物與疾病靶點取交集，通過Venn圖的形式展現(xiàn)黃芩與RA靶點間存在的交集靶點，運用Cytoscape 3.7.2（http：//www.Cytoscape.org/）軟件構(gòu)建黃芩治療RA的“化合物-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）的構(gòu)建

將篩選得到的藥物-疾病共同靶蛋白上傳至String（https：//string-db.org/）在線平臺數(shù)據(jù)庫進行蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）分析，限定研究物種為“人”（“homo sapiens”），參數(shù)保持默認設(shè)置，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO功能分析和KEGG通路富集分析

將黃芩的有效作用靶點上傳至David 6.8（data?base for annotation，visualization and integrated discov?ery）數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/，version 6.8），指定研究對象為人類進行基因功能（GO，gene ontolo?gy）分析，獲取靶點主要的作用過程，同時基于京都基因與基因組百科全書（KEGG，kyoto encyclopedia of genes and geomes）（https：//www.kegg.jp/）進行通路富集分析，觀察黃芩與RA共同靶點在通路中的分布情況。以P＜0.01進行靶基因篩選，得到黃芩靶點主要的生物過程和藥理作用機制中可能性較大的通路，并進一步篩選與RA相關(guān)的信號通路。

1.6 分子對接

檢索RSCB PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do）并下載RA 靶蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，檢索并下載TCMSP 數(shù)據(jù)庫黃芩活性成分的2D 結(jié)構(gòu)，利用Chem 3D 對活性成分小分子逐個進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化。利用PyMOL 2.4.0 軟件對RA 靶蛋白進行除水、分離原配體等預(yù)處理。利用AutoDock 的可視化軟件AutoDock Tools 1.5.6 軟件設(shè)置GridBox 各項參數(shù)，尋找活性口袋，并將活性小分子、預(yù)處理后的靶蛋白都轉(zhuǎn)換成pdbqt 格式文件，應(yīng)用AutoDock Vina 軟件進行分子對接，最后運用PyMOL、LigPlot＋軟件對對接結(jié)果進行三維和二維可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 黃芩活性成分的篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索黃芩化學(xué)成分，共得到143 個化學(xué)成分，再對其ADME 參數(shù)進行篩選，以O(shè)B ≥30 和DL ≥0.18 為篩選條件，同時篩去無對應(yīng)靶點的成分，最終共獲得36 個黃芩潛在的有效成分，見表1。

表1 黃芩潛在有效成分

2.2 黃芩活性成分-RA靶點預(yù)測

將從數(shù)據(jù)庫得到的所有成分和靶點去重整合，得到36 種活性成分及483 個靶點，靶點數(shù)較多的活性成分的潛在靶基因見表2（靶點數(shù)≥11），通過Unipot 數(shù)據(jù)庫進行標準化處理，匯總?cè)ブ睾蟮玫?6個靶點。設(shè)置relevance score ≥7，由GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索整合去重后得到RA 靶點共計1 085 個，將黃芩活性成分與RA各自對應(yīng)靶點取交集，得到活性成分-疾病靶點44個，對應(yīng)的韋恩圖見圖1。

表2 黃芩活性成分的潛在靶基因和靶點數(shù)（靶點數(shù)≥11）

圖1 黃芩活性成分與RA基因靶點映射Venn圖

2.3 “化合物-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

為更直觀的顯示黃芩有效成分、靶點與疾病之間的相互作用關(guān)系，利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建黃芩與RA的44個共同靶點的“化合物-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2），結(jié)果顯示，黃芩中發(fā)揮抗RA作用的化學(xué)成分主要有豆甾醇（stigmasterol）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）、黃芩甙元（baicalein）、漢黃芩素（wogonin）等，協(xié)同作用于一氧化氮合酶2（NOS2）、雄激素受體（AR）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶1（PTGS1）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成2（PTGS2）、β-2 腎上腺素能受體（ADRB2）、胱天蛋白酶3（CASP3）等靶點。

圖2 “化合物-靶點-疾病”可視化網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 黃芩治療RA的PPI網(wǎng)絡(luò)

設(shè)置置信度大于0.4，將Venn 圖獲得的44 個藥物-疾病共同靶點上傳至STRING 在線數(shù)據(jù)庫平臺得到PPI 網(wǎng)絡(luò)（見圖3）。據(jù)Count 值篩選列舉出黃芩治療RA的關(guān)鍵靶點蛋白（見圖4），主要包括白細胞介素-6（IL-6）、磷酸化蛋白激酶1（AKT1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、Jun激酶（JUN）、胱天蛋白酶3（CASP3）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成2（PTGS2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）等。

圖3 黃芩治療RA相關(guān)靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 黃芩治療RA的關(guān)鍵靶點

2.5 黃芩有效成分-靶點-分子功能的GO富集分析

將黃芩有效組分與RA 的共同44 個靶點導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫，篩選物種為人源（homo sapiens），獲得GO 生物學(xué)過程條目75 條，涉及到生長因子活性、生物合成過程調(diào)控、酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性及受體活性、細胞因子活性等各方面，選取GO 富集分析結(jié)果所得出的前20位相關(guān)靶點分子功能，繪制相應(yīng)的黃芩有效成分-靶點-對應(yīng)分子功能的GO富集分析柱狀以及氣泡圖，見圖5。結(jié)果顯示黃芩活性成分與靶點對應(yīng)的分子功能主要為核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、細胞因子受體結(jié)合、類固醇激素受體活性、血紅素結(jié)合等方面、蛋白質(zhì)異源二聚體活動、四吡咯結(jié)合、RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、BH域結(jié)合、近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合。

圖5 有效組分-基因靶點-分子功能的GO富集分析柱狀和氣泡圖

2.6 黃芩治療RA的KEGG通路富集分析

在DAVID 6.8在線數(shù)據(jù)庫中對44個靶點進行富集分析，以P<0.01為篩選標準，最終得出24條通路富集結(jié)果，見表3，主要是細胞凋亡、PI3K-Akt 信號通路、內(nèi)分泌抵抗、MAPK 信號通路、鉑類耐藥、HIF-1信號通路、p53信號通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、破骨細胞分化、細胞衰老、焦點粘連、Ras信號通路、細多種胞凋亡、VEGF信號通路、NF-kap?pa B信號通路、鞘脂類信號通路、FoxO信號通路、趨化因子信號通路等信號通路。

表3 KEGG通路富集

2.7 黃芩活性成分治療RA分子對接結(jié)果分析

使用Cytoscape中的CytoNCA對RA 靶點進行打分，得到網(wǎng)絡(luò)核心靶點，Degree ≥13的潛在靶點有14個，分別為：FOS、JUN、IL6、VEGFA、CXCL8、RELA、CASP3、MMP9、ESR1、CYCS、AKT1、MAPK14、PTGS2、CCL2。結(jié)合能小于0提示配體與受體可自發(fā)結(jié)合，且結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，所需結(jié)合能越低，本研究選取結(jié)合能≤-9.0 kcal/mol作為篩選條件，見表4。

表4 黃芩活性成分與靶蛋白的結(jié)合能

選取結(jié)合最穩(wěn)定的7 對配體受體組合（結(jié)合能≤-9.4 kcal/mol，進行可視化分析，相對應(yīng)三維與二維對接模式圖，見圖6。

3 討論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討研究了黃芩治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相互作用網(wǎng)絡(luò)與潛在治療機制，綜合表1、表2及圖2可得出黃芩主要有效化合物有36個，其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵成分有6個，為豆甾醇、β-谷甾醇、黃芩甙元及漢黃芩素。豆甾醇可改善RA大鼠的臨床嚴重程度關(guān)節(jié)破壞和組織結(jié)構(gòu)，還可下調(diào)關(guān)節(jié)中NF-κBp65 和p38MAPK 的表達，顯著抑制促炎介質(zhì)（TNF-抑制劑、IL-6、IL-1 抑制劑、iN?OS 和COX-2）在機體內(nèi)的表達，增加抗炎細胞因子（IL-10）的表達[4]。當RA組織內(nèi)巨噬細胞被高度激活時局部炎癥增強，可加速RA的發(fā)展。β-谷甾醇可抑制巨噬細胞促炎癥因子的產(chǎn)生，降低特異性抗體IgG的濃度，以此機制達到治療RA的作用[5]。黃芩甙元對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）所介導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維（RAFLS）增殖過程有顯著的抑制作用，能夠被巨噬細胞游走抑制（MIF）逆轉(zhuǎn)并呈劑量依賴性，提示黃芩甙元可能通過抑制MIF 信號通路來實現(xiàn)對TNF-α介導(dǎo)的RAFLS 增殖的抑制作用[6]。漢黃芩素可抑制RA 的成纖維樣滑膜細胞（FLS）中IL-6mRNA的表達，對RA的FLS增殖有明顯的抑制作用[7]。以上研究提示豆甾醇、β-谷甾醇、黃芩甙元及漢黃芩素為黃芩治療RA的重要活性成分。

結(jié)合圖1、2、3、4 可知，黃芩對應(yīng)96 個有效作用靶點，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎對應(yīng)1 085個靶點，二者共有44個交集靶點，其中關(guān)鍵作用靶點有IL-6、VEGFA、PTGS2、FOS、JUN、MMP9等。IL-6可誘導(dǎo)中性粒細胞產(chǎn)生血小板活化因子（PAF），PAF 可通過擴大炎癥反應(yīng)刺激FLS 增殖，促進血瘀形成，從而間接影響RA 藥物在體內(nèi)的吸收、代謝、分布[8]。此外，RA 發(fā)病的關(guān)鍵機制之一是IL-6 對骨組織的多效性作用，IL-6 可促使核因子κB 受體活化配體（RANKL）的表達[9]。有研究顯示，功能單核苷酸多態(tài)性VEGFA的等位基因的表達可能降低老年患者和環(huán)瓜氨酸抗體（ACPA）陰性患者患RA 的風(fēng)險[10]。在RA 中，PTGS2可促進FLS 增殖和炎癥反應(yīng)，PTGS2 的降低可起到挽救被抑制的miR-101-3p 在RA 大鼠滑膜損傷和FLS表型改變的作用[11]。有研究顯示，許多參與促炎/促破壞特性的關(guān)鍵蛋白，如趨化因子/細胞因子和基質(zhì)降解酶，都受到AP-1 及其亞基JUN、JUNB、JUND和FOS 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。FOS 啟動子（rs2239615、rs7101）和JUN 啟動子（rs4647009）的功能變異在RA 病例、膝關(guān)節(jié)炎病例和NC 人群中頻繁出現(xiàn)[12]。MMP9 可浸潤滑膜和軟骨下骨組織（包括破骨細胞）中的炎癥細胞、血管膜組織和多核細胞[13]。MMP9參與RA中關(guān)節(jié)的破壞，激活細胞因子和趨化因子，并通過降解上皮基底膜和血管系統(tǒng)促進組織破壞[14]。

對關(guān)鍵靶點進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，對探究黃芩治療RA的作用機制進一步進行探究。結(jié)果顯示，富集的生物學(xué)過程主要包括核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、細胞因子受體結(jié)合、類固醇激素受體活性、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)異源二聚體活動、四吡咯結(jié)合、RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合、BH域結(jié)合、近端啟動子序列特異性DNA結(jié)合等方面。KEGG通路富集分析得出，這些共同靶點參與了細胞凋亡、PI3K-AKT 信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路、破骨細胞分化、細胞衰老、趨化因子信號通路等信號通路的功能的調(diào)控。在有關(guān)RA 病機的研究中，研究人員在細胞凋亡時發(fā)現(xiàn)存在沖動可在病理細胞的大量積累時，可通過不同類型的干擾，致使正?；ぜ毎M一步凋亡，經(jīng)體外研究證實，這種由細胞凋亡干擾所引起的滑膜細胞集聚被認為是TNF和其他細胞因子的來源[15]。PI3K-AKT 信號通路已被證實與免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的疾病存在相關(guān)性[16]。MAPK信號通路負責(zé)調(diào)節(jié)產(chǎn)生促炎細胞因子的過程，該過程最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)發(fā)炎和破壞[17]。RA 患者滑膜組織可能通過下調(diào)MAPK 通路負向調(diào)節(jié)成骨細胞增殖[18]。Xue 等[19]研究表明，在關(guān)節(jié)軟骨細胞的自噬和骨關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)過程中，PI3K-AKT信號降低，該現(xiàn)象從側(cè)面反映了PI3K-AKT 信號通路與RA 發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。Malemud[20]的研究成果也顯示PI3K-AKT 信號在RA 細胞死亡中起關(guān)鍵作用?？筊A 的藥物通過調(diào)節(jié)MAPK 和VEGF 信號通路來抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生和表達，來減少膠原蛋白的產(chǎn)生、抑制滑膜細胞增殖并減弱其侵襲能力，從而發(fā)揮抗RA的作用。HIF-1參與了多條細胞信號通路的作用過程[21]，B 細胞中HIF-1α的高表達可通過促使機體內(nèi)IL-6 的產(chǎn)生進而影響T 細胞的分化[22]。骨細胞分化通路與RA 滑膜中許多物質(zhì)改變的通路有聯(lián)系。已有證據(jù)表明，RA 滑膜中所含有的破骨細胞可導(dǎo)致相應(yīng)受累關(guān)節(jié)的骨降解。Harshan等[23]證明了中性粒細胞胞漿因子（NCF）復(fù)合物在RA 滑膜中可產(chǎn)生活性氧（ROS）來驅(qū)動破骨細胞形成的信號通路上調(diào)。證明了T細胞受體信號通路的增強促進了受影響組織中破骨細胞的分化。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病早期，淋巴結(jié)間質(zhì)細胞（LNSCs）的衰老可能加速病情的發(fā)展，LNSCs是外周耐受性的重要調(diào)節(jié)因子，與淋巴細胞的接觸密切，因此，功能失調(diào)的衰老LNSCs會潛在地導(dǎo)致外周耐受性缺陷病和全身性自身免疫病的發(fā)病[24]。由趨化因子及其受體所介導(dǎo)的白細胞遷移在類風(fēng)濕滑膜類炎癥的遷延過程中發(fā)揮了重要的作用，該途徑可致RA滑膜細胞和破骨細胞對軟骨和骨的破壞[25]。

本研究通過分子對接，發(fā)現(xiàn)PTGS2 與黃芩中黃連堿、表小檗堿、刺槐素、5，7，2’，6’-泰特拉羥基黃酮、5，7，4’-三羥基-6-甲氧基黃酮、黃芩甙元和千層紙素等13種化學(xué)成分均與具有較好的結(jié)合性，對13種化學(xué)成分與PTGS2的結(jié)合模式進行分析，發(fā)現(xiàn)多個化合物與結(jié)合區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基Arg44、氨基酸殘基Cys36形成了較強的分子間氫鍵。同時，圖表顯示ESR1、RELA 與多個黃芩活性成分具有較好的結(jié)合性，提示黃芩可通過PTGS2、ESR1、RELA 途徑干預(yù)RA的活動。

4 結(jié)論

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究方法，構(gòu)建“黃芩有效成分-靶點-RA”網(wǎng)絡(luò)，同時從整體上分析了黃芩成分-靶點-信號通路之間的相互作用關(guān)系，推測中藥黃芩可通過豆甾醇、β-谷甾醇、黃芩甙元、漢黃芩素等潛在藥效成分協(xié)同作用于NOS2、PTGS1、AR、PTGS2、ADRB2、RELA、BCL2、CDKN1A、BAX、CASP3 等多個靶點，通過細胞凋亡、PI3K-AKT 信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路、破骨細胞分化、細胞衰老、趨化因子信號通路等多個信號通路協(xié)同作用，共同發(fā)揮治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用，初步揭示了黃芩治療RA的作用機制。但由于數(shù)據(jù)庫中納入的數(shù)據(jù)來源于不同的試驗條件以及研究領(lǐng)域的局限性，且中藥在煎煮提取過程中可能產(chǎn)成新成分的或破壞原有成分，故納入數(shù)據(jù)分析的成分不能完整全面反映其實際作用于人體的成分。因此，本文對于未來更深入的機制研究具有一定的參考價值，但黃芩治療RA的具體機制有待更進一步的實驗驗證。