黃 倩，楊 燕，劉 紅，孫 琴

1.西南醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學(xué) 中西結(jié)合學(xué)院（瀘州646000）；3.簡陽市人民醫(yī)院 藥學(xué)部（簡陽641400）；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 藥物研究中心（瀘州 646000）

復(fù)方紅景參丸源于本院經(jīng)驗方，是以紅景天、人參、丹參、麥冬、石斛制成的丸劑，具有益氣活血，健脾潤肺的功效，臨床上可用于預(yù)防和改善高原缺氧反應(yīng)。為將本品開發(fā)成具有耐缺氧活性的保健品，本研究在文獻檢索和預(yù)試驗研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計了3條工藝路線，并采用耐缺氧試驗篩選其活性，對篩選出的工藝路線進一步運用響應(yīng)面法對紅景天、麥冬、石斛3 味飲片的水煎煮工藝進行了優(yōu)化，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 實驗儀器與材料

1.1 儀器

2030C 3D 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；A560 型雙光束紫外分光光度儀（上海翱藝儀器有限公司）；ME155DU/02 型十萬分之一電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；ME204E/02 型萬分之一電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；101-2A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；BUCHI 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI 公司）。

1.2 實驗材料

1.2.1 實驗試劑紅景天苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110818-201708）；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水，其余均為分析純。

1.2.2 實驗藥材本實驗所涉及藥材（見表1），經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中醫(yī)藥專家鑒定合格。

表1 實驗藥材信息表

1.2.3 實驗動物SPF級昆明種成年小鼠，西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（SCXK（川）2018-17）。體重為18～22 g，雌性。該動物實驗已通過倫理審查。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 基于藥效學(xué)實驗篩選提取工藝

2.1.1 工藝路線設(shè)計由于復(fù)方紅景參丸的原方在臨床上以散劑、湯劑入藥，故本研究設(shè)計了全方打粉、全方水提2種工藝路線（詳見工藝路線1、工藝路線2）。

經(jīng)查閱文獻，君藥紅景天有健脾補氣、潤肺活血之功，主要化學(xué)成分包括皂苷類、黃酮類、鞣質(zhì)及揮發(fā)油等，其中具有抗缺氧活性的主要成分為紅景天苷，極易溶于水，宜采用水提法提取[1-2]。臣藥人參，補氣健脾，益肺生津，主要化學(xué)成分包括皂苷類、多糖類、微量元素及氨基酸等[3-6]，其中具有抗缺氧活性的成分人參皂苷類有醇水兩溶性[7-9]。麥冬，養(yǎng)陰潤肺生津，主要化學(xué)成分為甾體皂苷、高異黃酮、多糖及氨基酸等，麥門冬煎劑、麥門冬水提物、麥門冬注射液皆有提高常壓或減壓小鼠的耐缺氧能力[10-12]。石斛，可養(yǎng)陰生津益胃，主要含有生物堿類、聯(lián)芐類、菲類、氨基酸、倍半帖類及多糖類等化學(xué)物質(zhì)[13-17]，傳統(tǒng)入藥方式多采用水提。使藥丹參，活血安神，且其活性成分丹參總酮（脂溶性成分）和丹參總酚酸（水溶性成分）均具有抗缺氧的作用，同時對急性血瘀大鼠血液流變學(xué)、血小板聚集和凝血功能具有協(xié)同作用，二者配伍使用的效果大于單用效果[18-22]。

綜上，紅景天、石斛及麥冬的抗缺氧活性成分以水溶性成分為主[23-24]，考慮到人參為貴重藥材，丹參易粉碎，且人參、丹參中的耐缺氧活性成分既有水溶性成分又有醇溶性成分，二者打粉入藥既可以充分保留活性成分，亦可作為丸劑的賦形劑與崩解劑[25-27]。根據(jù)中國藥典四部現(xiàn)行版丸劑通則項下規(guī)定，供制丸劑用的藥粉應(yīng)為細粉或最細粉，故擬將處方中的人參、丹參飲片粉碎成細粉入藥（備用），紅景天、石斛、麥冬3 味采用水提（詳見工藝路線3），并以紅景天苷、總多糖的含量及浸膏得率為評價指標，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過多指標綜合評分法結(jié)合Box-Behnken 設(shè)計響應(yīng)面法優(yōu)化其水提取工藝，在最大程度上保證抗缺氧藥理作用的發(fā)揮。

3種工藝路線如下：

工藝路線1：紅景天、人參、丹參、麥冬、石斛均直接打粉；

工藝路線2：紅景天、人參、丹參、麥冬、石斛均水提；

工藝路線3：紅景天、麥冬、石斛水提，人參和丹參打粉。

分別按上述3種工藝路線制備樣品，按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》2003版“提高缺氧耐受力功能檢驗方法”項下要求進行“常壓缺氧耐受力實驗”（將SPF級KM小鼠隨機分為空白對照組、方式1組、方式2組及方式3組，在灌胃待測樣品提取物1 h后，將小鼠分別置于預(yù)先放入5 g鈉石灰的磨口錐形瓶中（一瓶一只），瓶蓋涂上凡士林，密閉使之不漏氣，立即計時，呼吸停止立即停止計時，計算小鼠存活時間。），“急性腦缺血性缺氧實驗（將SPF級KM小鼠隨機分為空白對照組、方式1組、方式2組及方式3組，在灌胃待測樣品提取物1 h 后，對小鼠進行斷頭處理，小鼠斷頭后腦部因有殘留氧氣會張口喘氣，自頸部斷頭立即按秒表計時，停止張口喘氣則計時結(jié)束。）”，選擇常壓缺氧小鼠和急性腦缺血性缺氧小鼠的存活時間為評價指標，篩選紅景參方的提取路線。結(jié)果見表2，給藥30 d，三種提取工藝均能不同程度延長小鼠在常壓缺氧狀態(tài)下以及在急性腦缺血性缺氧狀態(tài)下的存活時間，其中以工藝路線3 制備的樣品的抗缺氧活性最為顯著。因此，選用紅景天、麥冬、石斛水提，人參、丹參打粉作為紅景參丸的制備方法。

表2 藥物對存活時間的影響（）

表2 藥物對存活時間的影響（）

注：a表示與空白組比較P<0.05；b表示與空白組比較小鼠的急性腦缺血性缺氧存活時間的P<0.05；c表示與空白組比較小鼠的急性腦缺血性缺氧存活時間的P<0.01

2.2 基于響應(yīng)面法優(yōu)化紅景天、石斛及麥冬的水提 工藝

2.2.1 紅景天苷的含量測定

2.2.1.1 溶液的制備紅景天苷對照品溶液的制備取紅景天苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含1 010 μg 的母液，備用，臨用前稀釋成所需濃度即得。

2.2.1.2 供試品溶液的制備取干膏提取物粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定重量，超聲30 min，放冷，稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，即得。

2.2.1.3 紅景天陰性樣品取紅景天陰性樣品（過三號篩）約1 g，按照“供試品溶液的制備”項下制得紅景天陰性樣品溶液。

2.2.1.4 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性色譜柱為Dr-Maisch C18 色譜柱（46 mm，250 mm，5 μm）；以甲醇-乙腈-水(6∶4∶90）為流動相；檢測波長為275 nm；柱溫35 ℃；進樣量為5 μL；流速1 mL/min。理論板數(shù)按紅景天苷峰計算大于2 000，拖尾因子，分離度均小于1.5，色譜圖，見圖1。

圖1 紅景天苷對照品（A）、樣品（B）及陰性樣品（C）色譜圖

2.2.1.5 線性關(guān)系考察取上述1 010 μg/mL的紅景天苷對照品母液，稀釋成101 μg/mL，分別精密吸取稀釋后的紅景天苷對照品溶液4，6，8，10，12，14，16 μL，進樣，記錄色譜圖，測定其峰面積。以紅景天苷峰面積值（Y）對進樣量（X）進行回歸，繪制工作曲線，得回歸方程為y=342317x-2697.4（R2=0.9999）。以上結(jié)果表明，在0.404～1.414 μg 范圍內(nèi)，紅景天苷峰面積與進樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.2.1.6 精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性試驗①精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液5 μL，進樣6 次，測定紅景天苷峰面積，計算RSD=0.93%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

②穩(wěn)定性試驗 取同一批號供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h進樣5 μL，測定峰面積，計算RSD=2.37%（n=6），表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

③重復(fù)性試驗 取已知含量的提取物干膏粉末適量，研細（過三號篩），取6份，按“供試品溶液的制備”項下方法，制備供試品溶液，進樣5 μL，測定峰紅景天苷面積，計算RSD=2.00%，表明方法的重復(fù)性好。

2.2.1.7 加樣回收率試驗取供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，計算紅景天苷含量。另取樣品溶液適量，加入相同量的對照品，照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，重復(fù)6 次，分別計算其加樣回收率，平均加樣回收率=101.31%，RSD=2.77%。

2.2.2 總多糖的含量測定用苯酚-硫酸法測定總多糖的含量，取無水葡萄糖適量，精密稱定，加水制成每1 mL 含102.36 μg 的溶液。精密量取葡萄糖對照品溶液1，2，3，4，5，6 mL 于10 mL 的容量瓶中，加水定容，搖勻。取1 mL 溶液，加1 mL 的5% 苯酚溶液，搖勻，沿試管壁加入5 mL的濃硫酸，室溫下放置30 min，在485 nm波長處測其吸光度。以吸光度為縱坐，葡萄糖濃度為橫坐標，標繪制標準曲線，計算得到回歸方程為y=0.0097x+0.0586（R2=0.9995）。

樣品溶液的制備：取制備的提取液250 mL，將其濃縮成25 mL，取1 mL，加無水乙醇使其成90%醇溶液，靜置4 ℃過夜，5 000 r/min，離心10 min，用90%醇溶液洗滌2 次，取其沉淀，用水定容至2 000 mL，搖勻，即得。

2.2.3 測定干膏率精密吸取供試品溶液25 mL，用干燥至恒重的蒸發(fā)皿在水浴上蒸干溶劑，后于105 ℃烘箱內(nèi)干燥至重量不在改變，移至干燥器內(nèi)，冷卻30 min，立刻精密稱定其質(zhì)量。以干燥品計算供試品的干膏得率。干膏率（%）=（固形物質(zhì)量×供試液體積）/（提取飲片的總質(zhì)量×移取供試液體積）×100%。

2.2.4 單因素實驗浸泡時間的考察平行稱取復(fù)方飲片4份，料液比1∶12，煎煮時間90 min，提取2次的條件下，考察浸泡時間分別為0、30、60、90 min 對紅景天苷、總多糖及浸膏得率的綜合評分影響。實驗表明隨著浸泡時間的增加，紅景天苷及多糖提取率先增大后減小，但對浸膏得率影響不大，總體呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在30 min達到最佳，后隨著浸泡時間的增加。綜合評分結(jié)果見圖2A，隨著浸泡時間的增加，緩慢下降，浸泡時間應(yīng)控制在30～90 min，浸泡時間以60 min為中心點。

提取時間的考察平行稱取復(fù)方飲片5 份，料液比1∶12，浸泡60 min，提取2 次，考察提取時間分別為30、60、90、120、150 min 對紅景天苷、總多糖及浸膏得率綜合評分的影響。實驗表明，提取時間對紅景天苷的提取率影響不大，隨著提取時間的增加，總多糖的提取率及浸膏得率先增加后減小?？傮w來看，結(jié)果見圖2B，綜合評分隨著提取時間的增加而增加，當(dāng)時間為60 min 和90 min 達到最大值，90 min 后緩慢降低。選90 min作中心點。

料液比的考察，平行稱取復(fù)方飲片5份，浸泡60 min，提取90 min，提取2次，考察料液比分別為1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24對紅景天苷、總多糖及浸膏得率綜合評分的影響。結(jié)果見圖2C表明，加水量對綜合評分的影響顯著，隨著加水量的增加綜合評分顯著增加，在料液比為1∶20 時達到最高后趨于平緩，呈緩慢下降趨勢。為節(jié)約資源，減少后續(xù)干燥成本，選擇料液比的范圍為1∶12～1∶20，因料液比1∶16處于最佳選擇范圍，且綜合評分較高，故以料液比=1∶16作為響應(yīng)面法中料液比的中心點。

提取次數(shù)的考察平行稱取復(fù)方飲片3 份，料液比為1∶12，浸泡60 min，提取90 min，考察提取次數(shù)分別為1、2、3 次對紅景天苷、總多糖及浸膏得率綜合評分的影響。結(jié)果見圖2D。提取1次的綜合評分為68.77，提取2次為91.48，提取3次綜合評分為99.83。綜合評分增長顯著，提取3次為99.83對綜合評分的影響不大，考慮后續(xù)處理工藝，為節(jié)約成本提取2 次。

圖2 單因素考察結(jié)果圖

2.2.5 響應(yīng)面試驗

2.2.5.1 響應(yīng)面試驗的設(shè)計基于單因素實驗的結(jié)果，確定提取次數(shù)為2 次，把各評價指標的響應(yīng)值（y）作為響應(yīng)值，以浸泡時間（A），提取時間（B）和料液比（C）為因子，根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計原理，選擇紅景天苷提取率（Y1）、總多糖提取率(Y2）和干膏得率(Y3）的綜合評分（Y）（紅景天苷提取率、總多糖提取率、干膏得率權(quán)重系數(shù)分別為0.5、0.3、0.2）為響應(yīng)值，使用Design-Expert 8.0.6 軟件和Box-Behnken 設(shè)計了響應(yīng)面試驗。具體因素和水平情況見表3，實驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表3 響應(yīng)面試驗的因素與水平表

表4 響應(yīng)面試驗的方案及結(jié)果表

2.2.5.2 擬合模型與顯著性檢驗應(yīng)用Design-Ex?pert 8.0.6軟件對表3中的數(shù)據(jù)進行建模分析，獲得了具有綜合評分（Y）的浸泡時間（A），提取時間（B）和料液比（C）的多元回歸方程：y=94.79-0.7A（2.500E-003）B+3.81C+1.18AB+1.77AC-1.77AC-1.73BC-0.79A2-2.69B2-4.23C2。據(jù)表4，P<0.05，R2=0.9204故說明模型已達到顯著水平，且試驗結(jié)果受試驗因素影響的可能性為92.04%。另失擬項的P 值為0.1286，大于0.05，則試驗不存在明顯失擬因素。因此，用該回歸方程分析和預(yù)測最佳提取工藝是可靠的?；貧w方程各項分析中F 檢驗可以判斷自變量對因變量的影響，由此得到各因素對響應(yīng)值的影響程度為C（加水量）>A（浸泡時間）>B（提取時間）。

2.2.5.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析根據(jù)回歸模型，繪制相應(yīng)的等高線和響應(yīng)面圖，檢驗響應(yīng)面的形狀，分析各測試因素對評價指標綜合得分的影響（圖3，圖4）。相互作用的大小可以通過輪廓的形狀反映出來，如果是橢圓形的，這意味著兩個因素的相互作用是顯著的，如果是圓形的，則相反。通過對三組圖表的比較可以看出，提取時間和料液比之間的相互作用對綜合得分的影響最為明顯。三維圖形的表面較陡峭，提取時間與浸泡時間的交互作用對綜合評分影響不大。圖表的表面更平滑。通過Design-Expert 8.0.6 軟件對模型進行求解，得到紅景天、麥冬及石斛的最佳水提工藝參數(shù)∶浸泡時間59.07 min，提取時間85.21 min，加料液比1∶17.90，回流提取2 次?？紤]實際生產(chǎn)的可操作性，浸泡時間60 min，提取時間85 min，加水量為18倍，回流提取2次。

圖3 各因素對綜合評分影響的響應(yīng)面圖

圖4 各因素對綜合評分影響的等高線圖

2.3 驗證試驗

取紅景天、麥冬、石斛飲片三批，根據(jù)最佳工藝條件，即浸泡時間60 min，提取時間85 min，提取2次，加水量為18倍。測定紅景天苷提取率、總多糖提取率和干膏率，分別為5.82（mg/g），253.50（mg/g），44.79%，綜合得分為99.82。三批樣品各指標成分RSD均小于2.0%，表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

表5 回歸方程方差分析

3 討論

化學(xué)藥品成分簡單且明確，在對其工藝路線進行研究時，通常以一兩個成分的理化性質(zhì)為指標來考察并確定某一工藝路線。而中藥制劑成分復(fù)雜，采用單一指標確定其工藝路線不能充分發(fā)揮中醫(yī)藥的多組份多靶標的優(yōu)勢。如若采用藥效學(xué)指標和成分指標相結(jié)合的方式來優(yōu)化制備工藝路線，將使活性成分的提取更具有目的性、有效性和準確性。

本研究通過查閱文獻并結(jié)合原處方的臨床給藥方式制定出3 條工藝路線，以常壓缺氧小鼠和急性腦缺血性缺氧小鼠的存活時間為評價指標，以藥效學(xué)實驗評價提取工藝路線，結(jié)果顯示三種工藝制備的樣品均能不同程度延長小鼠在常壓缺氧狀態(tài)下以及在急性腦缺血性缺氧狀態(tài)下的存活時間，其中以紅景天、麥冬、石斛水提，人參和丹參打粉制備的樣品抗缺氧活性最為顯著。

目前，通過正交實驗來優(yōu)化提取工藝較為常見，但正交試驗是基于線性模型的，而在實際情況下，目標響應(yīng)值與因素之間的關(guān)系不一定是線性關(guān)系，非線性擬合最適用的方法為響應(yīng)面法。本實驗用單因素結(jié)合響應(yīng)面法來優(yōu)化紅景天、麥冬、石斛3味飲片的最佳水提工藝，得到最佳水提取工藝參數(shù)為∶加浸泡時間60 min，提取時間85 min，提取2次，加水量為18倍。該提取工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好，為將紅景參方開發(fā)成具有提高缺氧耐受活性的保健品奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實驗用單因素結(jié)合響應(yīng)面法來優(yōu)化紅景天、麥冬、石斛3味飲片的水提工藝，得到最佳水提取工藝參數(shù)為：浸泡時間60 min，提取時間85 min，提取2次，料液比1∶18。