羅林玉，張譽籍，趙繼凱，徐銀麗，于立明，薛曉東，王輝山

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 心血管外科，遼寧 沈陽 110016；2.大連醫(yī)科大學(xué)，遼寧 大連 116044

心力衰竭是影響心臟的多種疾病的最終途徑，發(fā)病率為1%～2%[1-2]。淀粉樣蛋白沉積是心力衰竭的潛在病因[3]，可發(fā)生在心室和心房，以及血管(特別是小血管)周圍和瓣膜，傳導(dǎo)系統(tǒng)也可能牽涉其中[4]。淀粉樣蛋白存在于全身，包括心肌、腎上腺、腎、肺、脾及周圍神經(jīng)等。本研究旨在觀察心臟移植心力衰竭患者心臟標(biāo)本中的淀粉樣蛋白沉積情況?，F(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自2013年1月至2021年2月因風(fēng)濕性心臟病進行瓣膜置換術(shù)的35例患者(風(fēng)濕性心臟病組)和因終末期心力衰竭進行心臟移植的35例患者(心力衰竭組)為研究對象。兩組患者均由同一術(shù)者進行手術(shù)。風(fēng)濕性心臟病組納入標(biāo)準(zhǔn)：患有風(fēng)濕性心臟瓣膜?。蛔笫疑溲謹?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)>0.4；心功能Ⅰ～Ⅱ級；臨床診斷達到瓣膜置換術(shù)標(biāo)準(zhǔn)；臨床資料完整。心力衰竭組納入標(biāo)準(zhǔn)：心臟疾病已到晚期；LVEF<0.4；心功能Ⅲ～Ⅳ級；臨床診斷達到心臟移植標(biāo)準(zhǔn)；臨床資料完整。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)?；颊呔橥?。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(KGIHC001)、一步法免疫組化試劑盒(KGOS60)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；APP(#2452)、GAPDH(14C10)、β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)(1-42)(D9A3A)、Aβ(1-40)(D8Q71)購自美國CST公司；辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗(abs20040)、剛果紅(abs42221387)購自北京愛必信生物技術(shù)有限公司；DAB顯色液(DA-1015)、DAPI(C0065)購自北京索萊寶公司；Masson三色染色液(BA-4079B)購自貝索公司；鹽酸乙醇快速分化液(C0163S)、BCA試劑盒(P0010)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL顯影液(P10300)購自蘇州新賽美生物科技有限公司。

1.2.2 主要儀器 低溫高速臺式離心機(Neofuge23R)購自上海力申科學(xué)儀器有限公司；超低溫冰箱(DW-86W420)購自青島海爾股份有限公司；Multiskan23R FC酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；Bio-Rad凝膠蛋白分離系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；凝膠曝光系統(tǒng)購自Tanon公司；石蠟包埋機(EG1150H+EG1150C)購自Leica公司；制冰機(YT-IMS-45)購自恒隆儀器有限公司；激光共聚焦顯微鏡(Nikon C2)購自日本Nikon公司。

1.3 研究方法

1.3.1 臨床資料 收集并記錄患者的年齡、住院天數(shù)、性別、超聲心動圖檢查結(jié)果，以及氨基末端腦利鈉肽(N-terminal pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP)水平。

1.3.2 免疫組化 分別從風(fēng)濕性心臟病組和心力衰竭組隨機選取10例患者，收集左室標(biāo)本。將標(biāo)本制成4 μm厚度的切片。采用SP免疫組化法進行染色。脫蠟修復(fù)后滴加Aβ1-40抗體(1∶200)、Aβ1-42抗體(1∶200)，4℃冰箱孵育過夜。次日取出復(fù)溫，生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育20 min，滴加現(xiàn)配DAB進行顯色。目標(biāo)抗體表達顯示為棕色，表達量以其占整個觀察視野的面積百分比表示。

1.3.3 Western Blot 收集待測組織，離心后留取細胞沉淀于1.5 ml EP管中，提取總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度，對各樣品進行蛋白定量，置入100℃沸水中5 min，冷卻后-80℃保存。采用8%的SDS-PAGE凝膠進行蛋白電泳，配制濃縮膠電泳1 h，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，APP抗體(1∶1 000)4℃過夜，次日TBST洗滌5次，每次8 min，二抗室溫孵育1 h，TBST再次洗滌5次，每次8 min，ECL顯色發(fā)光，照相。

1.3.4 Masson染色 將切片脫蠟至水，采用馬松三色染色法進行染色。染色后，肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍色或綠色。

1.3.5 剛果紅染色 將切片脫蠟至水，采用High-man甲醇剛果紅染色法進行染色。染色后，心肌組織標(biāo)本中的淀粉樣纖維呈紅色，細胞核呈藍色。

1.3.6 免疫熒光染色 將切片4.0%多聚甲醛固定、0.5% Triton X-100打孔、5.0% BSA封閉1 h后，滴加Aβ1-42抗體(1∶50)，4℃孵育過夜。次日PBS洗滌3次，每次5 min，避光加FITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶50)，室溫孵育1 h。DAPI對細胞核進行染色，滴加甘油進行封片，低溫避光保存。激光共聚焦顯微鏡成像觀察。染色后，Aβ呈綠色，DAPI呈藍色。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料 風(fēng)濕性心臟病組中，男性27例，女性8例；年齡(58.92±12.13)歲；住院天數(shù)(22.51±6.69)d；LVEF(54.51%±10.86%)；NT-proBNP (1 515.54±1 297.10)pg/ml。心力衰竭組中，男性29例，女性6例；年齡(51.43±10.41)歲；住院天數(shù)(27.71±21.51)d；LVEF(33.15%±12.57%)；NT-proBNP (4 437.00±3 138.00)pg/ml。

2.2 兩組Aβ表達水平比較 心力衰竭組Aβ表達水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1～3。

圖1 兩組Aβ表達水平比較(剛果紅染色；a.風(fēng)濕性心臟病組，b.心力衰竭組)圖2 兩組Aβ表達水平比較(免疫熒光染色；a.風(fēng)濕性心臟病組，b.心力衰竭組)

圖3 兩組Aβ表達水平比較(免疫組化)

2.3 兩組膠原纖維表達水平比較 心力衰竭組膠原纖維表達水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 兩組膠原纖維表達水平比較(Masson染色)

2.4 兩組APP表達水平比較 心力衰竭組APP表達水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 兩組APP表達水平比較(Western Blot)

3 討論

淀粉樣變性是淀粉樣蛋白原纖維在多個器官中的細胞外沉積而引起的一組疾病。淀粉樣纖維主要成分為心房鈉尿肽及其前體形式的氨基末端部分[5]。Sanbe等[6]研究指出，淀粉樣寡聚體存在于人類心力衰竭患者心肌細胞和動物結(jié)蛋白相關(guān)心肌病模型中。心臟作為內(nèi)分泌器官，可產(chǎn)生心房鈉尿肽[7-8]和腦利鈉肽[9]，兩者通過激活鳥苷酸環(huán)化酶A受體，促進第二信使3’，5’-環(huán)鳥苷一磷酸生成[10]，介導(dǎo)心肌保護及代謝功能，如抑制心肌細胞肥大和心肌纖維化、增強舒張功能、促進脂肪分解和白色脂肪細胞褐化等[11]。心房鈉尿肽和腦利鈉肽水平升高是心力衰竭的一個標(biāo)志[12]。NT-proBNP是腦利鈉肽前體降解后的化學(xué)結(jié)構(gòu)之一，可用于診斷心力衰竭。本研究中，心力衰竭組患者NT-proBNP水平明顯升高。

APP是β-淀粉樣前體蛋白，在體內(nèi)代謝為Aβ，細胞外和細胞內(nèi)Aβ(包括單體、寡聚及纖維形式)之間會通過多種機制引起小膠質(zhì)細胞浸潤、活性氧產(chǎn)生及突觸損傷等[13]。心肌中含有豐富的心臟成纖維細胞，約占心臟細胞群的10%～20%[14]。持續(xù)不斷的肌成纖維細胞活化驅(qū)動會引起過度纖維化，導(dǎo)致心臟組織順應(yīng)性下降，營養(yǎng)和氧氣輸送減少，心肌細胞萎縮及死亡，誘發(fā)進行性左室擴張和功能障礙[15-17]。本研究中：經(jīng)剛果紅染色、免疫熒光染色、免疫組化，心力衰竭組均出現(xiàn)Aβ表達，且表達水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Masson染色可見心力衰竭組膠原纖維表達水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Western Blot提示，心力衰竭組APP表達水平高于風(fēng)濕性心臟病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此推測，心力衰竭患者心肌中出現(xiàn)Aβ沉積可能與心肌纖維化有關(guān)，而這個過程可能由APP相關(guān)通路介導(dǎo)[18]。

綜上所述，心力衰竭的心臟移植患者出現(xiàn)心肌淀粉樣變性和心肌纖維化現(xiàn)象，心肌中Aβ沉積可能與心肌纖維化有關(guān)，且這個過程可能由APP相關(guān)通路介導(dǎo)。