牛樂 岳江濤 馮凱隆 梅江濤 賈曉康 戴先文

(西安市長安醫(yī)院骨科，陜西 西安 710016)

約95%的正畸患者在牙移動后出現(xiàn)正畸痛，近35%的正畸患者正畸痛持續(xù)遷延，經(jīng)久不愈[1-2]。正畸痛嚴重影響患者的預(yù)后及生活質(zhì)量，闡明其發(fā)病機制迫在眉睫[3-4]。環(huán)氧合酶 (Cyclooxygenase,COX)其同功酶有三種亞型：COX1、COX2及COX3。中樞神經(jīng)COX2對于神經(jīng)病理性痛的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要[5-6]。越來越多學(xué)者認為，脊髓和大腦的病理性改變決定了正畸痛的誘導(dǎo)和維持[7-8]。目前認為在三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核 (Trigeminal Nucleus Caudalis，Vc)出現(xiàn)的突觸可塑性改變和中樞敏化是正畸痛產(chǎn)生和維持的重要機制[9-11]。以往研究鮮少報道中樞COX2與正畸痛的相關(guān)性。本實驗以大鼠正畸痛模型為工具，以Vc為靶點，綜合運用各種實驗方法探討Vc內(nèi)COX2的表達變化以及與正畸痛的相關(guān)性，旨在從全新的角度探尋正畸痛的病理生理機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性清潔級SD大鼠24只，體重200～220 g，均購自于西安空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，本實驗操作均遵循Zimmermann教授有關(guān)善待動物的倫理學(xué)條例[12]，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 大鼠隨機分為實驗性牙正畸痛組(Experimental Tooth Movement Pain,ETMP組)，假手術(shù)對照組(Sham組)和空白對照組(Naive組)，每組8只。

1.2.2 實驗設(shè)計

1.2.2.1 每組在造模前和造模后4 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d先進行痛覺行為學(xué)檢測，然后利用免疫組化染色、免疫熒光染色和Western blot檢測Vc內(nèi)COX2的表達變化。

1.2.2.2 在痛覺閾值最低時間點，鞘內(nèi)注入各種環(huán)氧合酶抑制劑進行行為藥理學(xué)檢測，同時在Vc進行免疫熒光雙重染色。

1.3 動物模型的建立

1.3.1 ETMP組 大鼠有16顆牙齒，分上頜左+上頜右+下頜左+下頜右總共4個區(qū)，每區(qū)有1顆切牙和3顆磨牙，在上頜左+上頜右2個區(qū)，先在第一切牙與第一磨牙分別套上微型橡皮筋，然后利用微型彈簧連接2個橡皮筋進行牽拉，注意套上微型橡皮筋及微型彈簧時防止損傷到牙周組織，實景圖見圖1A ，不同時間點進行痛覺行為學(xué)檢測[13-15]。

1.3.2 Sham組 造模過程同ETMP組，只在第一切牙與第一磨牙分別套上微型橡皮筋，不用微型彈簧連接。

1.3.3 Naive組 大鼠未經(jīng)任何處理。

1.4 痛行為學(xué)檢測 提前將大鼠置于背景噪聲為45 db的房間內(nèi)適應(yīng)環(huán)境30 min，然后將大鼠置于一個透明的塑料籠子里(45 cm×45 cm×45 cm)，籠內(nèi)有被褥和攝像頭。所有大鼠在開始記錄前至少適應(yīng)15 min的測試環(huán)境，對大鼠的面部搔抓活動進行10 min的錄像記錄，連續(xù)記錄三次，取三次記錄的平均值，得出每只動物的記錄值[13-15]。

1.5 形態(tài)學(xué)

1.5.1 切片制備 深麻大鼠，插管至主動脈，先以磷酸緩沖液(PB)快速沖洗血液，再以4%多聚甲醛灌注固定。隨后切取延髓，移入30%蔗糖的PB過夜。恒冷切片機切片，片厚25 μm。

1.5.2 免疫組化及免疫熒光染色 0.01 M 磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗切片3次，兔抗COX2 (Chemicon)室溫下孵育過夜；FITC熒光標記的二抗或生物素化的二抗室溫孵育6 h；FITC熒光標記的切片用熒光顯微鏡觀察；針對生物素標記的切片，A、B液混合后(Vector，1：200)孵育切片2 h，各免疫反應(yīng)步驟之間均用PBS漂洗，最后以0.05%DAB呈色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片，普通顯微鏡觀察。

1.5.3 免疫熒光雙標染色 漂洗切片, 兔抗COX2分別與羊抗Fos (Santa Cruz), 小鼠抗NeuN (Chemicon)共同孵育；漂洗,入熒光二抗；漂洗，裱片，封片；激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.6 Western blot檢測 腹腔注射1%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)深麻醉大鼠，冰上處死后取出延髓組織；用RIPA法裂解組織提取總蛋白，進行蛋白定量；制備SDS-PAGE膠，上樣電泳；電泳結(jié)束后將蛋白樣品由凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，以抗COX2的一抗4℃孵育過夜；次日復(fù)溫1 h后以相應(yīng)的二抗37℃孵育40 min；加入化學(xué)發(fā)光劑后，暗室曝光，得到COX2和β-actin條帶；通過與β-actin條帶對比的相對灰度值比較各組樣品之間蛋白的表達差異。

1.7 行為藥理學(xué)

1.7.1 腦室內(nèi)置管 參照以往方法，用甲氧氟烷氣體快速麻醉大鼠，將大鼠置于立體定向框架上，在延髓背側(cè)植入聚乙烯管(PE10)，聚乙烯管末端深達蛛網(wǎng)膜下腔，此方法已在國際公認，經(jīng)導(dǎo)管注入藥物后，可有效作用于Vc[16]。

1.7.2 給藥 ETMP組痛覺閾值最低時間點，鞘內(nèi)給藥SC-560 (COX1選擇性抑制劑)，NS-398 (COX2選擇性抑制劑)，indomethacin (COX非選擇性抑制劑) 或acetaminophen (COX3選擇性抑制劑)，溶劑對照組給予相當量的溶劑，觀察鎮(zhèn)痛效果。

2 結(jié)果

2.1 ETMP組大鼠形成了正畸痛，并且Vc內(nèi)COX2染色密度顯著增加 Sham組和Naive組沒有出現(xiàn)痛覺行為學(xué)表現(xiàn)，即面部搔抓時間在各個時間點都處于基準水平，見圖1B。與Sham組[(9.1±1.2)s]和Naive組[(10.0±1.3)s]相比，ETMP組在牙移動后4 h[(17±3.6)s]形成了顯著的痛覺行為學(xué)表現(xiàn)，即面部搔抓時間顯著增加，并且在1 d[(35±6.7)s]時達到巔峰(P<0.05)，見圖1B。隨后痛覺過敏開始逐漸減退，并且在第7 d[(10.1±1.5)g]時痛覺過敏接近消失，恢復(fù)到正常水平。與Sham組相比，ETMP組Vc內(nèi)COX2的免疫組化染色密度出現(xiàn)了顯著增加，見圖1C。

圖1 ETMP組大鼠形成了正畸痛，且Vc內(nèi)COX2染色密度顯著增加

2.2 ETMP組Vc內(nèi)COX2的表達顯著提高，并且與痛覺行為學(xué)密切相關(guān) Western blot檢測顯示，與Naive組(0.1±0.005)和Sham組(0.1±0.01)相比，ETMP組Vc內(nèi)COX2的蛋白表達水平在牙移動后4 h(0.35±0.06)出現(xiàn)了顯著提高，COX2表達的增加在牙移動后1 d(0.6±0.07)達到巔峰(P<0.05)，見圖2A。隨后COX2表達的增加開始逐漸減少，并且在第7 d(0.18±0.04)時恢復(fù)到基準水平； ETMP組COX2的表達變化與痛覺行為學(xué)(面部搔抓時間)呈顯著的正相關(guān) (P<0.001)，見圖2B。這提示在正畸痛時，Vc內(nèi)COX2的過表達有可能對于痛覺信息的調(diào)控至關(guān)重要。

圖2 ETMP組Vc內(nèi)COX2的表達顯著提高，并且與痛覺行為學(xué)密切相關(guān)

2.3 ETMP組Vc內(nèi)COX2由神經(jīng)元生成，并且大部分COX2陽性神經(jīng)元處于激活狀態(tài) ETMP組Vc內(nèi)的免疫熒光染色密度出現(xiàn)了顯著增加，COX2免疫陽性結(jié)構(gòu)主要集中在VcⅠ-Ⅱ?qū)?圖3A～B)；在Vc內(nèi)進行的免疫熒光雙重染色顯示，COX2免疫陽性結(jié)構(gòu)只是存在于NeuN免疫陽性神經(jīng)元(圖3C～E)，大部分COX2陽性神經(jīng)元為Fos 陽性(圖3F～H)。

圖3 ETMP組Vc內(nèi)COX2由神經(jīng)元生成，并且大部分COX2陽性神經(jīng)元處于激活狀態(tài)

2.4 Vc內(nèi)COX2的過表達導(dǎo)致了正畸痛的產(chǎn)生 在ETMP組大鼠模型痛覺閾值最低的時間點1 d，相比溶劑對照組[(33.1±6.2)s]，經(jīng)延髓背側(cè)蛛網(wǎng)膜下腔給予NS-398[(17.2±3.2)s]能夠產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用(P<0.05)。而給予SC-560 [(32.8±4.3) s]或acetaminophen[ (33.5±5.5)s]對于痛覺閾值沒有任何影響，見圖4。這提示在正畸痛時，Vc內(nèi)COX2的過表達導(dǎo)致前列腺素等炎性介質(zhì)的大量生成，最終增強疼痛信號的傳遞，導(dǎo)致異常疼痛的形成。

圖4 Vc內(nèi)COX2的過表達導(dǎo)致了正畸痛的產(chǎn)生

3 討論

正畸治療通過對錯位的牙、牙弓或頜骨施加一定的矯治力來達到矯治畸形的目的。疼痛使患者懼怕正畸治療，甚至放棄治療。隨著患者對治療舒適度要求的增加，認識正畸治療中的疼痛特點，尋找正畸疼痛發(fā)生及變化的規(guī)律，有效地減輕或防止治療過程中的疼痛，成為正畸醫(yī)師關(guān)注的研究熱點[1-4]。以往對正畸痛的研究都集中在牙周組織的病變，而本實驗率先提出中樞延髓水平COX2的過表達導(dǎo)致了正畸痛的產(chǎn)生，以期能夠在中樞神經(jīng)水平對正畸痛進行有效的干預(yù)和治療，為正畸痛的預(yù)防治療提供了一個新的靶點。

以往學(xué)者在大鼠上頜第一切牙與第一磨牙之間利用微型彈簧連接，成功建立了實驗性大鼠正畸痛模型，該模型大鼠在牙移動后形成了顯著的痛覺行為學(xué)表現(xiàn)，即面部搔抓時間顯著增加，且痛覺程度、時程與臨床正畸痛患者極為相似，因而該模型認為是研究正畸痛的理想動物模型[13-15]。本實驗成功復(fù)制了該模型。先在第一切牙與第一磨牙分別套上微型橡皮筋，然后利用微型彈簧連接2個橡皮筋進行牽拉，ETMP組在牙移動后4 h面部搔抓時間顯著增加，并且在1 d時達到巔峰，隨后痛覺過敏開始逐漸減退。而臨床上大部分正畸痛患者在正畸后1 d時最痛，1周后疼痛逐漸減輕，這說明本研究實驗動物其痛覺表現(xiàn)與臨床實際情況極為相似，是研究正畸痛的理想動物模型。

傳統(tǒng)觀點認為，正畸時牙周神經(jīng)末梢受到機械或化學(xué)刺激是正畸痛發(fā)病的主要原因，但越來越多的學(xué)者認為周圍神經(jīng)病變不能完全解釋正畸痛的發(fā)生、發(fā)展過程，脊髓和大腦的病理性改變更多地決定了正畸痛的誘導(dǎo)和維持[7-8]。有學(xué)者利用功能性磁共振成像發(fā)現(xiàn)正畸痛患者Vc，前扣帶回皮質(zhì)等與中樞痛覺信息調(diào)控密切相關(guān)的核團或腦區(qū)處于過度代謝和激活狀態(tài)[17-18]。

COX是合成前列腺素過程中的重要限速酶。COX2為誘導(dǎo)型COX，參與機體的各種病理應(yīng)激反應(yīng)，廣泛分布于脊髓和大腦，中樞COX2對于神經(jīng)病理性痛的調(diào)節(jié)作用越來越得到研究者的關(guān)注[5-6, 19]。

Vc作為頭面部痛覺信息傳遞調(diào)控的閘門，具有關(guān)鍵作用[10-11]，故本實驗從新的切入點，即延髓Vc水平，探討和研究正畸痛的發(fā)病原理。本研究結(jié)果顯示，正畸痛大鼠Vc內(nèi)COX2的染色密度和蛋白表達水平顯著提高，COX2的表達上調(diào)和痛覺閾值的減低(面部搔抓時間顯著增加)呈顯著相關(guān)，鞘內(nèi)給予COX2的特異抑制劑能產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用。

在本實驗中，ETMP組經(jīng)延髓背側(cè)蛛網(wǎng)膜下腔給予NS-398 能夠產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用，而給予SC-560 或acetaminophen對于痛覺閾值沒有任何影響。這提示延髓COX1或COX3并沒有參與ETMP組疼痛的形成和維持，只有COX2參與了正畸痛的形成和維持。免疫熒光組織化學(xué)雙重染色顯示，COX2由Vc淺層內(nèi)激活的神經(jīng)元細胞生成。以上實驗結(jié)果從全新的角度詮釋正畸痛的病理生理機制，為臨床診療正畸痛提供新的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究以大鼠正畸痛模型為工具，以Vc為靶點，綜合運用藥理行為學(xué)、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法研究Vc內(nèi)COX2的表達變化以及與正畸痛的相關(guān)性，從全新的角度探尋正畸痛的病理生理機理。Vc內(nèi)COX2的上調(diào)參與了ETMP大鼠痛覺行為學(xué)的形成，這一結(jié)果發(fā)現(xiàn)對指導(dǎo)新型鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)和正畸痛的治療等方面，都將具有積極的促進作用。