劉尚，呂文，宋茜，程鵬，崔艷

1. 天津農(nóng)學院食品科學與生物工程學院，天津農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術中心（天津 300384）；2. 天津市利民調(diào)料有限公司（天津 300308）

白葡萄酒因其香氣清爽，果香、花香濃郁，顏色較淺，更適于新鮮飲用。但一直以來白葡萄酒在原酒貯藏過程中極易發(fā)生氧化而導致其典型性香氣和風味成分的損失、褐變的發(fā)生，還可能產(chǎn)生令人不悅的味道，大大降低白葡萄酒的飲用品質(zhì)[1]。通常成品酒中的這種現(xiàn)象是由于酒中的酚類物質(zhì)通過非酶氧化生成H2O2，引發(fā)芬頓反應從而產(chǎn)生氧化性極強的羥基自由基，進一步將乙醇、乙醛和酒石酸等氧化成醛酮，然后聚合導致酒體的氧化褐變[2-4]。還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的活性三肽，因其分子中半胱氨酸的巰基易被氧化生成二硫鍵而呈現(xiàn)較強的還原性[5]，它可以與乙醛結(jié)合形成乙醛酸加成產(chǎn)物，抑制乙醛酸衍生二倍體的形成，從而阻斷聚合反應，抑制葡萄酒的氧化，阻止黑色物質(zhì)的產(chǎn)生，有效地抑制白葡萄酒的褐變[6-7]，同時在原酒貯藏期它還能起到保護芳香物質(zhì)如乙酸乙酯、芳樟醇、a-松油醇等的作用[8]。因此，近年來還原型谷胱甘肽GSH在葡萄酒釀造中的應用及其替代SO2的潛能越來越多地受到國內(nèi)外研究人員的關注，GSH的適度添加能夠明顯改善葡萄酒尤其是白葡萄酒的品質(zhì)[9-10]。而低醇白葡萄酒因為酒精度低、殘?zhí)歉?、發(fā)酵終止困難、不耐久藏，貯藏期更易發(fā)生氧化、褐變而造成品質(zhì)下降[11]。但是，到目前為止，GSH對低醇葡萄酒的影響仍鮮有報道。故試驗以新鮮的低醇玫瑰香白葡萄酒為研究對象，在原酒貯藏期添加GSH，檢測原酒貯藏過程中其對1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）、2, 2-聯(lián)氮-二-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）-二銨鹽（ABTS）、羥自由基（OH-）和超氧陰離子（O2-）等自由基的清除能力及酒中酚類含量和GSH殘留量的變化，以評估GSH的添加在低醇白葡萄酒貯藏期間的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低醇玫瑰香白葡萄酒（7%，V/V，實驗室自釀）。

還原型谷胱甘肽GSH（北京索萊寶科技有限公司）；2, 2-聯(lián)氮-二-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）-二銨鹽（ABTS）；1, 1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）（上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗方案

向新鮮釀造的低醇玫瑰香白葡萄原酒中分別添加0，5，10，15和20 mg/L的還原型谷胱甘肽GSH，封瓶常溫儲存，在添加GSH后的第1，第3，第5，第7和第9個月的貯藏過程中，分析研究GSH對該酒的抗氧化性的影響，分別檢測其對DPPH、ABTS、OH-及O2-自由基的清除率。

1.2.2 低醇白葡萄酒的抗氧化性研究

1.2.2.1 對DPPH自由基的清除作用[12]

取100 μL用蒸餾水稀釋30倍的酒樣，加入到4 mL 6.25×10-5mol/L DPPH乙醇溶液中，反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度。用等體積的蒸餾水加入DPPH乙醇溶液中作對照。DPPH自由基清除率按式（1）計算。

式中：As為加入酒樣所測吸光度；A0為加入乙醇所得吸光度。

設計存在著因果關系，因為需要，才有了設計。許多“壞”設計是因為設計師沒有理解這其中的因果關系，不理解設計的目的，沒有進行深入的調(diào)研，便從一開始就錯在了起點。設計師真正存在的意義在于，了解因，得出果。項目設計師從民眾調(diào)研出發(fā)，以解決問題為出發(fā)點，好的設計來源于生活，更介入生活改變生活。

1.2.2.2 對ABTS自由基的清除作用[13]

準確稱取0.1920 g ABTS、0.0331 g過硫酸鉀于燒杯中，用去離子水定容至50 mL，使ABTS濃度為7 mmol/L，過硫酸鉀的濃度為2.45 mmol/L。將該溶液于室溫暗處靜置12～16 h。將配制好的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.4）進行稀釋，直至734 nm下吸光度為0.70。取20 μL酒樣，再加入2 mL ABTS反應液，振蕩搖勻，室溫下靜置10 min，測定吸光度，以不加酒樣的ABTS自由基溶液為空白對照，ABTS自由基清除率按式（2）計算。

式中：AS為樣品管的吸光度；A0為對照管的吸光度。

1.2.2.3 對羥基（OH-）自由基的清除作用[14]

在測定管（A1）和對照管（A2）中分別依次加入1 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1 mL酒樣、1 mL 6 mmol/L雙氧水，在空白管（A0）中用蒸餾水替代酒樣，充分振蕩后靜置20 min，向A1和A0中分別加入1 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，向A2中加入1 mL蒸餾水，充分振蕩混勻后靜置30 min，用紫外分光光度計測定在520 nm下的吸光度，A0，A1和A2分別表示對應管的吸光度。羥基（OH-）自由基清除率按式（3）計算。

1.2.2.4 對超氧陰離子自由基的清除作用[15]

準確稱取4.5 mL 0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液，于25 ℃水浴預熱20 min，加入0.1 mL酒樣和0.4 mL 2.5 mmol/L鄰苯三酚，混勻后在水浴中反應4 min，然后立即用2滴8 mol/L的HCl終止反應，在300 nm下測定吸光度?？瞻捉M以蒸餾水代替酒樣，并按式（4）計算超氧陰離子自由基清除率。

參考王華[16]總酚含量的測定。

1.2.4 GSH含量的檢測[17]

1.2.4.1 標準曲線的繪制

配制0.10 g/L GSH溶液，根據(jù)試驗情況取0～1.0 mL不同體積，加水至1.0 mL，再加3 mL Tris-HCl緩沖溶液，混勻后取1.0 mL加到5 mL的DTNB溶液中，混勻并反應5 min，于412 nm測定吸光度，繪制標準曲線。

1.2.4.2 GSH含量的測定

取1.0 mL酒樣，按上述DTNB法測定吸光度，由標準曲線獲得GSH的含量。

1.3 統(tǒng)計學分析方法

使用WPS Excel 11.1.0.9339版做統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH對低醇白葡萄酒中DPPH自由基的影響

由圖1可以看出，GSH確實能夠較有效地清除DPPH自由基。隨著添加GSH處理時間的延長，DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)先快速上升后逐漸降低的趨勢，且所有添加GSH組均明顯高于對照組的25%左右。在添加GSH處理酒樣的第1個月，所有GSH組對DPPH自由基的清除率均快速上升，且不同添加量組無明顯區(qū)別。在1個月時均達到最大約60%，其中10 mg/L GSH組的DPPH清除率最高（61.8%），緊隨其后為15 mg/L組（61.4%）。隨后1～3個月出現(xiàn)較快下降趨勢。在第3個月時，15 mg/L GSH組清除率降低至40.96%，為最高，而5 mg/L組為GSH添加組中的最低，為35.42%。第3～第9個月逐漸趨于平穩(wěn)，到第9個月，GSH添加組均降至31%左右。且在1～9個月期間15 mg/L GSH組的清除率均為最高。說明0～3個月的GSH處理時間對清除DPPH自由基的作用更強，1個月為最佳處理時間，且不同添加量僅在1個月之后才有較大差別。

圖1 GSH對酒中DPPH自由基清除率的影響

2.2 GSH對低醇白葡萄酒中ABTS自由基的影響

由圖2可知，添加GSH對酒中的ABTS自由基的清除率影響較大，其對ABTS自由基的清除能力遠高于DPPH。圖2中ABTS自由基的清除率也是隨著GSH處理時間的延長先升后降，1個月時清除率達到最高值，其中15 mg/L GSH組最大（91.3%），其次為20 mg/L組（89.1%），最低為5 mg/L組（86.1%）。1個月后，清除率緩慢下降；1～3個月，清除率基本保持在80%～90%之間；且15 mg/L GSH組對ABTS的清除率始終最高；在第3個月降至85.1%，在第9個月降至57.3%。而對照組對ABTS自由基的清除率變化較小，由開始的60.3%降至最終55%左右，但第7～第9個月GSH組和對照組差異縮小?？梢姾蛯PPH的清除作用相似，ABTS的最佳GSH處理時間也為1個月，且第1～第3個月表現(xiàn)較好，15 mg/L GSH組在整個過程中均保持最高的清除率。

圖2 GSH對酒中ABTS自由基清除率的影響

2.3 對低醇白葡萄酒中羥基（OH-）自由基的影響

由圖3可知，GSH對低醇白葡萄酒中OH-自由基的清除能力較DPPH和ABTS自由基的要高，且GSH組明顯高于空白對照?？梢钥闯鲈诘?～第1個月，隨著GSH處理時間的延長，GSH添加組對OH-自由基清除率升高，在第1個月達到最大，15 mg/L GSH組的清除率達到95.6%，隨后略有下降，且該組在9個月的處理過程中，清除率始終高于90%，其他GSH組則在第7個月后清除作用下降至90%以下，此時不同的添加量組才表現(xiàn)出較大的差異，到第9個月清除率最低為5 mg/L組，降至86.5%。對照組起始清除率約為88%，在第9個月降至85.2%，酒體自身對羥基自由基的清除率較高。說明添加GSH對清除OH-自由基作用明顯。且最佳GSH處理時間也為1個月，但該清除作用持續(xù)時間較長，當GSH添加量為15 mg/L時，清除效果最好，但在第3～第5個月，添加量的差異并不明顯。

圖3 GSH對酒中OH-的清除率的影響

2.4 GSH對低醇白葡萄酒中超氧陰離子自由基的影響

圖4 GSH對酒中超氧陰離子清除率的影響

2.5 添加GSH對低醇白葡萄酒中總酚含量的影響

由圖5可知，添加GSH對低醇玫瑰香白葡萄酒的總酚含量確實有一定的影響。由于該酒為低醇白葡萄酒，總酚的初始含量只有2.7 mg/mL。由圖5可見，無論是對照組還是添加GSH組，總酚含量均呈下降趨勢，其中對照組下降最多、最明顯，GSH處理9個月之后，其總酚含量降至僅0.6 mg/mL，下降1.3 mg/mL。而總酚含量下降最緩慢平穩(wěn)的為20 mg/L GSH組，9個月后僅降至1.7 mg/mL；其次為15 mg/L GSH組，10 mg/L GSH組和5 mg/L GSH組，說明GSH的添加量與總酚含量有密切的關系，添加GSH可抑制酒中總酚含量的下降，且隨著GSH添加量增大，抑制作用增強，證實GSH具有保護酚類物質(zhì)、減緩酚類物質(zhì)氧化和總酚含量損失的作用，這與梁曉芳等[18]報道的GSH對于干白葡萄酒品質(zhì)影響的結(jié)果相一致，也進一步驗證了GSH的自由基清除能力及抗氧化性。但是也可以看出GSH添加量對總酚含量的下降的抑制作用與其清除自由基的能力并不完全一致。20 mg/L GSH組的總酚保持最多，但其他四種自由基的清除能力并不是最強?？赡芨摼浦锌偡雍枯^低有關。

圖5 GSH處理期間中酒中總酚含量的變化

2.6 不同處理時間的酒樣中GSH的殘留量

根據(jù)前述自由基清除作用的結(jié)果，表1列出了GSH添加量為15 mg/L組的1～9個月的5個不同處理時間的酒樣中，處理結(jié)束后GSH的殘留量?？梢钥闯?，添加15 mg/L GSH處理后，酒樣中最終的GSH殘留量均高于對照組，而對照組的GSH含量也說明葡萄自身含有GSH或在葡萄酒釀造過程中是可以產(chǎn)生GSH的。同時，隨著處理時間的延長，添加量相同的GSH在酒中的殘留量是下降的，由第1個月的28.7 mg/L下降至9個月后最終的14.2 mg/L。說明無論是后添加的GSH，還是葡萄酒自身產(chǎn)生的GSH，在儲酒的過程中均參與了酒體中的反應從而導致GSH含量的下降?？赡苁瞧渑c酒中的乙醛、咖啡酸、酒石酸等發(fā)生了反應生成加成產(chǎn)物，抑制酒體的氧化反應。同時GSH與自由基之間的反應隨著處理時間延長而減少，因此后期自由基的清除率逐漸降低。這與其抗氧化性和總酚含量的變化是基本一致的。

表1 不同處理時間酒樣中GSH的殘留量 單位：mg/L

3 結(jié)論

經(jīng)過對低醇玫瑰香白葡萄酒在原酒貯藏階段采用GSH進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GSH的添加能有效地清除該酒中的四種自由基，其自由基清除效果由高到低依次為OH-＞ABTS＞DPPH＞，其中對羥自由基和ABTS自由基的清除效果最強，超氧陰離子最弱。綜合來看，四種自由基均在GSH處理1～3月內(nèi)清除率較高，其中當GSH添加量為15 mg/L，處理1個月時清除率最高，抗氧化性最好。同時，GSH的添加能有效減緩該酒中總酚物質(zhì)的損失，其殘留量也隨著處理時間延長而下降，也說明GSH可以保護酚類物質(zhì)、減緩氧化速率，具有抗氧化性。此次研究可為還原型谷胱甘肽在低醇葡萄酒釀造和后期貯藏中的應用提供參考。