岳陽，封張萍，王夢婷，朱艷云，陳健初，葉興乾

浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，馥莉食品研究院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程中心（杭州 310058）

我國是稻米生產(chǎn)大國，具有豐富的大米資源，2019年我國稻谷產(chǎn)量為14500萬 t，占全球大米總產(chǎn)量的30%[1]。大米中大米蛋白的含量占到8%左右。大米蛋白不僅具有良好的氨基酸組成配比、極高的營養(yǎng)價(jià)值，并且具有低敏性，因此可被用作嬰兒食品。目前，在大米的生產(chǎn)加工過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)物——米渣，往往被用作飼料，其中仍然具有大量的大米蛋白，有待被考慮再利用以減少蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)。大米蛋白的深度開發(fā)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈的延長成為目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

目前的許多研究表明，自由基的水平影響到人體內(nèi)多種疾病的發(fā)生，如癌癥、糖尿病、心腦血管疾病等[2-4]?？寡趸钚晕镔|(zhì)作為自由基清除劑，能夠有效降低人體內(nèi)自由基的水平，幫助機(jī)體抵御疾病。目前應(yīng)用最廣泛的是化學(xué)合成類抗氧化劑如BHT、BHA等，但由于其存在一定的副作用，影響了食品藥品的安全性[5]。天然抗氧化劑除了具有較強(qiáng)抗氧化活性，還有很高的安全性，因此，目前人們把研究重點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)向天然抗氧化劑。據(jù)報(bào)道，蛋白經(jīng)水解后得到的肽類具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是目前的研究熱門之一，如玉米抗氧化肽[6]、鷹嘴豆抗氧化肽[7]等。也有文獻(xiàn)報(bào)道了大米蛋白經(jīng)過酶解，能夠得到具有抗氧化肽活性的肽段，具有清除自由基和抑制生物大分子過氧化的潛力[8]，但是如何提高大米抗氧化肽的抗氧化能力和得率還需要進(jìn)一步優(yōu)化。

人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種信息處理模型[9]，可通過計(jì)算機(jī)模擬人腦的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。如今，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以通過誤差反向傳播機(jī)制來調(diào)整輸入層、隱含層和輸出層中神經(jīng)元的權(quán)值和閾值，從而反映輸入和輸出之間的非線性關(guān)系[10-12]。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是具有自我學(xué)習(xí)、自我適應(yīng)和非線性映射功能的黑匣子模型，可以解決復(fù)雜問題并為未知系統(tǒng)建模，被廣泛應(yīng)用于花青素[13]、生物活性肽[12,14]、發(fā)酵過程[12]等提取加工工藝參數(shù)的優(yōu)化。遺傳算法（genetic algorithms，GA）是一種基于進(jìn)化生物學(xué)中的自然選擇學(xué)說和遺傳進(jìn)化原理來實(shí)現(xiàn)隨機(jī)、自適應(yīng)，并進(jìn)行全局搜索的群體尋優(yōu)算法[15-16]。遺傳算法和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)合可以有效地克服傳統(tǒng)優(yōu)化方法的缺點(diǎn)，從而使得計(jì)算更為容易和高效[17-18]。

以中性蛋白酶水解大米蛋白來制備大米抗氧化肽，探究不同酶解工藝參數(shù)（反應(yīng)溫度、體系pH、料液比、酶添加量）對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和抗氧化性的影響，并且在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)、訓(xùn)練建立酶解工藝模型，結(jié)合遺傳算法進(jìn)行尋優(yōu)，以獲得最佳的大米抗氧化肽酶解制備工藝條件，為大米蛋白資源綜合利用提供了理論研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米蛋白，西安維珍科技有限責(zé)任公司。

中性蛋白酶，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ABTS二銨鹽，美國Sigma公司；無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、過硫酸鉀等均為分析級(jí)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-10數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″仯饓锌平軆x器廠；1510全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher公司；MS105 DU電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；MB100-2A微孔板恒溫振蕩器，北京原平皓生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大米抗氧化肽的制備

稱取大米蛋白粉，加入一定量的蒸餾水，置于電磁攪拌臺(tái)上充分?jǐn)嚢枞芙?，于恒溫水浴鍋中預(yù)熱至一定溫度，加入NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至目標(biāo)值，加入適量中性蛋白酶啟動(dòng)反應(yīng)，水解過程中通過不斷滴加NaOH溶液維持pH恒定，水解至預(yù)定時(shí)間后，沸水浴滅酶10 min，冷卻后，以6000 r/min離心20 min，取上清液測定ABTS自由基清除率及水解度。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

酶促反應(yīng)受到溫度、pH、料液比、酶添加量等多種因素影響，因此考察了不同因素對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化性及水解度的影響。分別選擇反應(yīng)溫度（25，30，35，40，45，50，55和60 ℃）、體系pH（6.5，7，7.5，8和8.5）、料液比值（4，7，10，13，16和19 g/100 mL）、酶添加量（2800，3600，4400，5200和6000 U/g）等因素考察對(duì)大米抗氧化肽抗氧化性及水解度的影響。

1.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶解物ABTS自由基清除率為響應(yīng)值，選取反應(yīng)溫度、體系pH、料液比、酶添加量作為響應(yīng)因子，利用Design-Expert 軟件進(jìn)行四因素三水平的Box- Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

1.3.4 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及遺傳算法優(yōu)化工藝

1.3.4.1 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立

設(shè)計(jì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)為三層結(jié)構(gòu)（輸入層、隱含層、輸出層），將Box-Behnken試驗(yàn)中的考察因素作為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入層[19]，輸入層設(shè)計(jì)4個(gè)神經(jīng)元，分別代表反應(yīng)溫度、體系pH、料液比值、酶添加量；將響應(yīng)值作為輸出層，輸出層設(shè)計(jì)1個(gè)神經(jīng)元，代表ABTS自由基清除率；隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)由公式（1）[20]計(jì)算可得。

式中：h為隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)；m為輸入層節(jié)點(diǎn)數(shù)；n為輸出層節(jié)點(diǎn)數(shù)；a為1～10之間的調(diào)節(jié)常數(shù)（1≤a≤ 10）。

最終，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為4-12-1型的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)；利用Python編寫程序，建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用該網(wǎng)絡(luò)模擬仿真大米抗氧化肽的制備過程，進(jìn)而分析各因素對(duì)ABTS自由基清除率的影響。

1.3.4.2 選擇樣品及訓(xùn)練網(wǎng)絡(luò)

使用“留一法”進(jìn)行樣本的選擇，即隨機(jī)將樣本分為兩部分，一部分用作訓(xùn)練，另一部分作為檢測樣本[12]。研究使用Box-Behnken試驗(yàn)獲得的29組數(shù)據(jù)，選擇25組作為訓(xùn)練樣本，其余4組作為檢測樣本。

采用均方誤差（MSE）評(píng)估模型的性能，均方誤差越小，表明訓(xùn)練的網(wǎng)絡(luò)精度越高，模型模擬效果越好[21]。網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練過程中，設(shè)定訓(xùn)練目標(biāo)誤差為0.0001，學(xué)習(xí)速率為0.01，各節(jié)點(diǎn)的激活函數(shù)為tanh。

1.3.4.3 遺傳算法尋優(yōu)

遺傳算法是用于解決最優(yōu)化問題的全局多點(diǎn)搜索算法，它使用概率轉(zhuǎn)移規(guī)則進(jìn)行搜索[22-23]?；谠撎卣?，將訓(xùn)練后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測結(jié)果（ABTS自由基清除率）用作遺傳算法的個(gè)體適應(yīng)度函數(shù)值。 根據(jù)適應(yīng)度值從每一代的個(gè)體中選出高級(jí)的個(gè)體并反復(fù)進(jìn)行選擇、交叉和變異，直到獲得具有最高函數(shù)值的個(gè)體，并解碼相應(yīng)的參數(shù)（反應(yīng)溫度、體系pH、料液比值、酶添加量）的實(shí)際值。在優(yōu)化計(jì)算過程中，設(shè)定最大進(jìn)化代數(shù)為120，種群大小為20，交叉概率為0.7，變異概率為0.05，通過冒泡算法，挑選每代適應(yīng)度最大的20個(gè)個(gè)體進(jìn)入下次進(jìn)化過程，最后得到每代種群適應(yīng)度變化結(jié)果。

1.3.5 指標(biāo)測定方法

1.3.5.1 水解度測定

參考鄰苯二甲醛（OPA）法[24]測定水解度，以絲氨酸（0.9516 mmol/L）作為標(biāo)準(zhǔn)溶液、去離子水作為空白組，將400 μL樣品溶液加入到一個(gè)裝有3 mL OPA試劑的測試管中（時(shí)間點(diǎn)0），混合均勻（5 s），精確反應(yīng)2 min后立即讀取340 nm的吸光度。按式（2）～（4）計(jì)算。

式中：x為樣本中蛋白質(zhì)含量；h0為水解反應(yīng)前樣品相對(duì)原始底物的水解度；h1為水解反應(yīng)后樣品相對(duì)原始底物的水解度；htot為食源性蛋白質(zhì)水解度常數(shù)，根據(jù)不同的底物蛋白會(huì)有所不同，大米蛋白的htot為6.4 mmol/g。

1.3.5.2 ABTS自由基清除率測定

采用文獻(xiàn)[25]的方法稍作修改。10 mL的7 mmol/L ABTS水溶液中加入179 μL的140 mmol/L高硫酸鉀水溶液在暗室室溫下孵育14 h配制ABTS母液。取300 μL ABTS母液用蒸餾水稀釋到10 mL得到ABTS工作液。將170 μL ABTS工作液加入酶標(biāo)板中，再加入20 μL已稀釋100倍的酶解液，充分混合，在37 ℃下振蕩孵育10 min，測其在734 nm下的吸光度Ai，以20 μL的去離子水作為空白對(duì)照，記其吸光度A0。

1.3.5.3 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，采用Excel和SPSS 22.0軟件進(jìn)行比較分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行Tukey差異分析，以p＜0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 反應(yīng)溫度對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和抗氧化性的影響

如圖1所示，在25～50 ℃的范圍內(nèi)，隨溫度升高，產(chǎn)物水解度增加，抗氧化性也隨之增強(qiáng)。當(dāng)反應(yīng)溫度為50 ℃時(shí)水解度及ABTS自由基清除率最高。當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃，與反應(yīng)溫度為55 ℃相比水解度顯著降低（p＜0.05），這主要是由于在一定范圍內(nèi)溫度的升高可以使得酶的活性增強(qiáng)，加快酶促反應(yīng)速率。但溫度過高，反而會(huì)使酶天然構(gòu)象遭到破壞，導(dǎo)致酶活性降低，從而使酶解效率降低[26]。50 ℃和55 ℃時(shí)對(duì)水解度和ABTS自由基清除率沒有顯著性差異（p＞0.05）。因此，為了減小能耗，選擇酶解溫度50 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 反應(yīng)溫度對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和ABTS自由基清除率的影響

2.1.2 體系pH對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和抗氧化性的影響

酶活性中心基團(tuán)的解離狀態(tài)與體系pH密切相關(guān)，從而影響到酶的活性。試驗(yàn)分析了體系pH在6.5～8.5范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物的水解度和ABTS自由基清除率的變化情況。由圖2可見，水解度和ABTS自由基清除率隨著pH的升高，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。最適的pH有利于酶與底物的結(jié)合，酶解效率也能達(dá)到最高值[27]。由圖2可知，pH為8.0時(shí)，大米蛋白的水解度和酶解液ABTS自由基清除率達(dá)到最大，pH為8.5時(shí)，酶的分子結(jié)構(gòu)開始改變、催化活性降低，導(dǎo)致ABTS自由基清除率顯著下降（p＜0.05），水解度降低。由此選擇體系pH 8.0進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 體系pH對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和ABTS自由基清除率的影響

2.1.3 料液比值對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和抗氧化性的影響

如圖3所示，隨著料液比值的增加，酶解產(chǎn)物的ABTS自由基的清除率增加。這主要是由于料液比值的增加使得酶解底物增加，因此酶解程度增強(qiáng)且酶解產(chǎn)物增多，進(jìn)而提升酶解液對(duì)ABTS自由基的清除率。但當(dāng)料液比值增加到一定程度后，ABTS自由基清除率增速變緩直至不再增加。這可能是由于隨著底物濃度的增加，產(chǎn)物濃度也隨之提高，產(chǎn)生了產(chǎn)物抑制效應(yīng)。另外，酶解產(chǎn)物的水解度隨著料液比值的增加先增大后減小，原因可能是當(dāng)料液比值達(dá)到一定程度時(shí)，酶與底物的結(jié)合達(dá)到飽和[28]。當(dāng)料液比值為13和16 g/100 mL時(shí)，酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除率無顯著差異（p＞0.05）。但是在料液比值16 g/100 mL時(shí)，ABTS自由基清除率更高、水解度更大，因此料液比值選擇16 g/100 mL。

圖3 料液比值對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和ABTS自由基清除率的影響

2.1.4 酶添加量對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和抗氧化性的影響

如圖4所示，酶解液水解度和對(duì)ABTS自由基的清除率在酶添加量2800～4400 U/g的范圍內(nèi)整體隨著加酶量的增加而提升，主要原因是酶量的增加促使酶解反應(yīng)速率加快，底物蛋白水解更加充分，得到的目標(biāo)產(chǎn)物量也隨之上升；但當(dāng)酶添加量大于4400 U/g后，酶解產(chǎn)物的ABTS自由基清除率出現(xiàn)下降，此時(shí)水解度繼續(xù)上升，這可能是由于過多的酶將發(fā)揮抗氧化作用的肽段進(jìn)一步水解，導(dǎo)致其抗氧化能力下降[29-30]。因此，最終確定酶添加量4400 U/g，以此優(yōu)化值進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。

圖4 酶添加量對(duì)酶解產(chǎn)物水解度和ABTS自由基清除率的影響

2.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立

根據(jù)1.3.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行四因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)及訓(xùn)練過程見圖5，經(jīng)過31272次學(xué)習(xí)和訓(xùn)練，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的均方誤差MSE達(dá)到0.0001，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)收斂，結(jié)束訓(xùn)練。

圖5 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)及訓(xùn)練過程

圖6為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練結(jié)果評(píng)估圖，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值對(duì)試驗(yàn)值的回歸曲線，方程的R2為0.91418，表明神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測值與試驗(yàn)值之間存在良好的線性關(guān)系，該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有較高的精度，能夠用于模擬仿真。

圖6 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果評(píng)估

2.3 遺傳算法尋優(yōu)

種群適應(yīng)度值（ABTS自由基清除率）迭代變化曲線見圖7。由圖7可知，隨著進(jìn)化代數(shù)的增大，種群的適應(yīng)度呈現(xiàn)曲折上升的趨勢，種群迭代進(jìn)化48代以后，種群適應(yīng)度達(dá)到最大值，然后趨于穩(wěn)定。運(yùn)行程序進(jìn)行求解可得，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)最優(yōu)適應(yīng)度值（ABTS自由基清除率）為82.22%，對(duì)應(yīng)的各參數(shù)值為反應(yīng)溫度50 ℃，體系pH 8.1774，料液比值17.6452 g/100 mL，酶添加量4374.1935 U/g。為便于實(shí)際操作，將各參數(shù)值進(jìn)行適當(dāng)修正，結(jié)果為反應(yīng)溫度50 ℃，體系pH 8.2，料液比值17.65 g/100 mL，酶添加量4374 U/g。

圖7 遺傳算法尋優(yōu)過程

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證遺傳算法尋優(yōu)結(jié)果的可靠性，因此對(duì)上述所得最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，通過3次平行試驗(yàn)，實(shí)際測得ABTS自由基清除率為81.51%，與尋優(yōu)的預(yù)測值相近，這表明通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)訓(xùn)練和遺傳算法尋優(yōu)所得到的技術(shù)參數(shù)是可靠的。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以大米蛋白為原料，通過中性蛋白酶酶解制備大米抗氧化肽，采用ABTS自由基清除率評(píng)價(jià)酶解所得產(chǎn)物的抗氧化能力。試驗(yàn)根據(jù)反應(yīng)溫度、體系pH、料液比值、酶添加量四種影響因子的單因素試驗(yàn)，得到反應(yīng)溫度50 ℃，pH 8.0，料液比值16 g/100 mL，酶添加量4400 U/g的優(yōu)化條件用于后續(xù)研究。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)的因素水平和響應(yīng)值，以python軟件建立BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)擬合影響大米抗氧化肽制備的4個(gè)主要因素和ABTS自由基清除率之間的非線性關(guān)系，經(jīng)過學(xué)習(xí)和訓(xùn)練之后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有良好的預(yù)測性和準(zhǔn)確性，能夠反映反應(yīng)溫度、體系pH、料液比值、酶添加量與ABTS自由基清除率之間的關(guān)系，結(jié)合遺傳算法進(jìn)行全局尋優(yōu)，可確定大米抗氧化肽最優(yōu)的提取工藝條件。最后，求得的大米抗氧化肽最優(yōu)提取工藝為反應(yīng)溫度50 ℃，體系pH 8.2，料液比值17.65 g/100 mL，酶添加量4374 U/g。

綜上，基于大米抗氧化肽酶解過程中工藝參數(shù)與ABTS自由基清除率之間存在的非線性關(guān)系，利用Box-Behnken試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，通過python軟件編程，建立了能夠反映主要提取工藝參數(shù)與大米抗氧化肽ABTS自由基清除率之間非線性關(guān)系的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，且經(jīng)學(xué)習(xí)及訓(xùn)練后的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有良好的預(yù)測性和準(zhǔn)確性，并通過遺傳算法，實(shí)現(xiàn)了大米抗氧化肽酶解工藝參數(shù)的尋優(yōu)求解，為試驗(yàn)研究及生產(chǎn)實(shí)踐中面臨的具有非線性關(guān)系的多目標(biāo)同步優(yōu)化問題提供了一種新的解決方案。大米抗氧化肽作為一種天然的抗氧化劑，值得深入研究和開發(fā)，試驗(yàn)結(jié)果為大米蛋白的綜合開發(fā)利用提供了有價(jià)值的參考。