林童 ，張旭，周燈銀 ，王壽容，吳智艷 ，解春艷

1. 廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院（廊坊 065000）；2. 河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心（廊坊 065000）；3. 廊坊市微生物發(fā)酵研究重點實驗室（廊坊 065000）

小麥?zhǔn)鞘澜绲诙蠹Z食作物，其總產(chǎn)量僅次于玉米，中國小麥產(chǎn)量居世界首位，年產(chǎn)量在1億 t以上[1]。小麥籽?？煞譃榕哐?、胚乳和表皮3個部分，其中胚芽營養(yǎng)價值最高，含有麥粒中64%的維生素B1、26%的維生素B2和21%的維生素B6，此外還富含氨基酸、蛋白質(zhì)、泛酸、煙酸、生育酚等營養(yǎng)成分[2-5]，小麥胚芽（簡稱麥胚）因其極高的營養(yǎng)特性而被營養(yǎng)學(xué)家譽為“人類的天然營養(yǎng)寶庫”，因而在醫(yī)藥、食品等多個行業(yè)越來越受到重視，麥胚蛋白成為最有吸引力和最有前途的蔬菜蛋白質(zhì)來源之一。

麥胚由于其含油量高，以及高脂肪酶和脂氧合酶活性，容易氧化和酸敗，產(chǎn)生苦味，難以儲存，限制其保質(zhì)期，因此通常用于牲畜飼料，被當(dāng)作副產(chǎn)品摻入到麩皮中低價出售，其中的營養(yǎng)價值并沒有被充分開發(fā)和利用，造成資源的巨大浪費[6]。近年來，隨著社會的進步和科技的發(fā)展，從小麥中獲取生物活性物質(zhì)備受國內(nèi)外關(guān)注，尤其是對麥胚蛋白及其性質(zhì)的研究越來越多。Vasconcelos等[7]發(fā)現(xiàn)麥胚具有較高的抗氧化活性，可作為健康食品的生物活性成分；Adom等[8]研究證明麥胚蛋白抗氧化活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小麥籽粒其他部位的抗氧化活性；Zhu等[9]研究發(fā)現(xiàn)麥胚蛋白酶解產(chǎn)物具有較強的抗氧化活性，且與Fe2+的螯合是其抗氧化作用的主要核心。麥胚蛋白具有如此高的抗氧化活性，被公認(rèn)為是健康食品配方的一種有價值的功能成分，因此提高麥胚蛋白提取效率及其抗氧化活性具有重要意義，也引起很多研究者關(guān)注。

最初對小麥蛋白的提取方法是堿溶酸沉法，但與大豆和酪蛋白產(chǎn)物相比，這種方法提取的麥胚蛋白分離物具有較低的功能特性[10]，此外，有機試劑的使用會對環(huán)境造成一定的污染，在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)過程中也會增加企業(yè)的生產(chǎn)成本。隨著酶技術(shù)發(fā)展，酶水解被廣泛應(yīng)用于改善和提升食品蛋白質(zhì)的功能和營養(yǎng)特性。王丹丹等[11]采用中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解脫脂麥胚蛋白制取小麥胚芽蛋白肽，水解后的產(chǎn)物具有較強的抗氧化能力；郭紅英[12]用堿性蛋白酶酶解麥胚蛋白后得到小麥胚芽多肽，可以使丙二醛-過氧化模型鼠中脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)的終產(chǎn)物含量大大降低；程云輝[13]以麥胚蛋白為原料，體外抗氧化活性為指標(biāo)，研究了酶解麥胚蛋白的最合適蛋白酶和最佳水解工藝。然而上述研究僅是對麥胚蛋白粗酶解液的研究，如果進一步進行細(xì)致的分離純化研究，對深入研究麥胚蛋白的作用、提高小麥胚芽肽的抗氧化性及深度挖掘小麥胚芽蛋白的價值將具有重要意義。

試驗以麥胚蛋白為原料，DPPH清除自由基能力為指標(biāo)，采用不同蛋白酶及酶解工藝的優(yōu)化，確定最佳水解酶的種類及酶解條件，利用葡聚糖凝膠層析對酶解后的產(chǎn)物進行分離，初步獲得3種小麥胚芽肽蛋白組分，通過每種組分的含量和抗氧化能力測定，篩選出最佳組分，并通過對該組分進一步分離純化得到單一胚芽肽蛋白，提高其抗氧化能力。試驗通過一系列條件優(yōu)化及后期分離純化，增強麥胚蛋白對羥基自由基和超氧自由基的清除能力，這為抗氧化肽的研究提供經(jīng)驗，從麥胚蛋白中開發(fā)抗氧化肽，不僅原料來源廣、成本低，而且能夠提升麥胚蛋白的營養(yǎng)價值，創(chuàng)造更高的社會效益和經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

小麥胚芽（廊雪面粉食品有限公司）；堿性蛋白酶[20萬 U/g，鴻潤寶順有限責(zé)任公司（北京）]；風(fēng)味蛋白酶[20 U/g，都萊生物技術(shù)有限公司（南京）]；木瓜蛋白酶（200萬 U/g，美國Sigma公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH，南京奧多?？颇嵘锟萍加邢薰荆籊ly-Gly-Tyr-Arg（安徽合肥博美生物有限公司）；葡聚糖凝膠G-50、葡聚糖凝膠G-25（生工生物工程有限公司）；無水乙醇、三氯乙酸、氫氧化鈉等試劑（均為分析純，國藥集團有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TDL-40B低速離心機（上海安廷科學(xué)儀器廠）；BuchiKjeIFlex K-360凱氏定氮儀（上海島應(yīng)用科技有限公司）；PHS-25-01型pH計（艾普計量儀器有限公司）；電子天平（上海躍平科學(xué)儀器制造有限公司）；HL-2D定時數(shù)顯恒流泵（上海滬西分析儀器廠有限公司）；德國Christ真空冷凍干燥機（上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司）；BSZ-100自動部份收集器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；752N紫外分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇榮華儀器制造有限公司）；美國Bio-rad680 iMark酶標(biāo)儀（上海史瑞克生物科技有限公司）；層析柱16 mm×20 cm、層析柱16 mm×50 cm（北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司）；ZXRD-B5210型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；搖擺式粉碎機（山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

麥胚于105 ℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中穩(wěn)定化處理80 min，用粉碎機中粉碎過篩，得到小麥胚芽粉；按照100 g小麥胚芽粉加入200 mL石油-乙醚的比例，于恒溫水浴鍋中80 ℃提取14 h小麥胚芽粉，脫去其脂肪，獲得小麥胚芽蛋白。

1.3.2 DPPH自由基清除率測定

采用比色法[14]，用無水乙醇將DPPH固體配成1× 10-4mol/L溶液，各溶液均勻混合，避光處理30 min，用酶標(biāo)儀在波長為517 nm條件下測定吸光度，利用式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：Ai為1 mL蛋白水解液（稀釋10倍）+1 mL 1× 10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液的吸光度；Aj為1 mL蛋白水解液（稀釋10倍）+空白試劑（無水乙醇）的吸光度；A0為1 mL 1×10-4mol/L DPPH無水乙醇溶液+空白試劑（無水乙醇）的吸光度。

1.3.3 麥胚抗氧化肽的分離純化

分離純化麥胚的抗氧化肽[15]，分別用葡聚糖凝膠G-50與G-25。葡萄糖凝膠使用前用蒸餾水充分浸泡溶脹，并用超聲處理除去氣泡，裝柱并用蒸餾水平衡。樣品上樣之前用0.22 μm微孔濾膜過濾，加入0.5 mL水解液，用蒸餾水洗脫，流速0.5 mL/min。采用部分收集器收集自凝膠柱下端流出的液體，每管3 mL，在280 nm波長下檢測吸光度，將同一吸收峰的液體進行合并，冷凍濃縮干燥。

1.3.4 肽含量測定

配制一系列不同濃度的四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5%三氯乙酸將其定容至10 mL，吸取6 mL溶液于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑（NaOH 2.4 mL+CuSO41.6 mL），充分混勻，靜置10 min，以2000 r/min離心10 min，取上清液，于540 nm測吸光度。以縱坐標(biāo)是吸光度，肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，制作多肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

吸取2 mL樣品溶液于試管中，向試管加入2 mL 10 g/mL的三氯乙酸溶液，混勻后靜置30 min，以5000 r/min離心20 min，取1 mL上清液，加入4 mL雙縮脲試劑，靜置30 min充分反應(yīng)，在540 nm波長處測定吸光度[17]。

1.3.5 麥胚抗氧化肽抗氧化特性的測定

試驗測定麥胚的總抗氧化性能力、羥自由基清除能力與抗超氧陰離活力，按照南京建成生物有限公司試劑盒的說明書進行操作，其中，總抗氧化性以Trolox為參考，按式（2）計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶篩選

將底物濃度為2%的小麥胚芽蛋白溶液分別加入濃度均為4000 U/g堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，調(diào)節(jié)至各蛋白酶的最適溫度和最佳pH，混合均勻，酶解3 h，沸水浴滅酶10 min，冷卻后調(diào)至pH 4.0，以5000 r/min離心15 min，取上清液調(diào)至pH 7.0，測定上清液的DPPH自由基清除率，如圖1所示，麥胚蛋白由堿性蛋白酶水解得到的水解液對DPPH自由基的清除率最高，為55.7%±1.8%，木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對DPPH自由基的清除率相當(dāng)，分別為29.1%± 6.1%和31.2%±3.5%。由于不同的蛋白酶作用于不同的酶切位點，而麥胚蛋白中堿性蛋白酶的酶切位點比其他兩種酶的酶切位點多[18]，因此，麥胚蛋白用堿性蛋白酶水解后能夠生成更多的多肽，從而其水解液對DPPH自由基的清除能力最強。

圖1 不同蛋白酶對DPPH自由基清除率

2.2 酶解工藝優(yōu)化

采用單因素控制法分別研究加酶量、酶解時間、pH、底物濃度和酶解溫度等因素對DPPH自由基清除率的影響。如圖2（a）所示，加酶量在1000～3000 U/g范圍內(nèi)，隨著加酶量增加，DPPH自由基清除率增幅增大，加酶量5000 U/g時接近平衡，主要是因為反應(yīng)體系中酶的量過多時，酶分子達到過飽和，沒有多余的蛋白質(zhì)和酶結(jié)合，所以反應(yīng)速率不再變化[19]。圖2（b）是酶解時間對DPPH自由清除率的影響圖，在1.5～3 h范圍內(nèi)，隨著時間增加，酶解后的DPPH自由基清除率增長很快，在3～4 h范圍內(nèi)上升速度減緩，在4 h時達到最大值后開始下降。這是由于隨著時間延長，蛋白酶水解生成抗氧化肽含量增加，繼續(xù)水解會進一步導(dǎo)致生成的抗氧化肽被蛋白酶水解，從而導(dǎo)致氨基酸結(jié)構(gòu)序列發(fā)生變化，而多肽的抗氧化性與氨基酸序列有很大關(guān)系[20]，故隨著時間延長，初期清除DPPH自由基能力增加，而后變緩并稍微有所降低。在pH方面，如圖2（c）所示，在pH 7.5～8.0范圍內(nèi)，自由基清除能力逐漸增加，在pH 8.0～10.0范圍內(nèi)逐漸下降。pH能改變酶的結(jié)構(gòu)，從而影響酶與底物的結(jié)合，最終影響酶解狀態(tài)[21]。圖2（d）是底物濃度對DPPH自由基清除率影響圖，底物濃度1%～6%時，酶解液對自由基的清除率迅速增長，底物濃度6%～8%時趨于平緩，這是由于底物與酶結(jié)合位點的多少受底物濃度的大小所影響，底物濃度越小，底物和酶結(jié)合的位點越少，反應(yīng)速率越慢，底物與酶結(jié)合位點的數(shù)目隨著底物濃度的增加而增多，結(jié)合位點增多時，反應(yīng)速率也會增加。在底物濃度超出某個閾值時，沒有更多的酶與底物結(jié)合，且溶液過于黏稠，從而影響底物與酶的結(jié)合[22]。如圖2（e）所示，隨著溫度升高，蛋白水解液的DPPH自由基清除率隨之升高，在50 ℃時清除率達到最大值，而后DPPH自由基清除率開始逐漸下降。由于每種酶都有其反應(yīng)的最適溫度，在這個溫度下酶的活性最高，反應(yīng)速率也最快，然而超過這個溫度或低于這個溫度，均會改變酶的結(jié)構(gòu)，從而降低酶的活性，因此隨著酶解溫度的增加，蛋白酶解液的DPPH自由基清除能力先增加后減低。

圖2 單因素條件優(yōu)化

通過單因素試驗，以底物濃度（A）、酶解溫度（B）、pH（C）、加酶量（D）和酶解時間（E）作為考察因素，利用顯著性方差分析確定正交試驗的各因素及水平，結(jié)果如表1所示，設(shè)計L16(45)正交表并進行正交試驗（表2），以DPPH自由基清除率作為考察指標(biāo)[23]，確定出制備小麥胚芽抗氧化肽的最優(yōu)酶解工藝，試驗得出A、B、C、D、E各因素的R值分別為0.307，0.0189，0.0280，0.0400和0.0293，對麥胚蛋白酶解效果影響順序依次為A＞D＞E＞C＞B，即底物濃度是影響麥胚蛋白酶解最大的因素，其次加酶量和酶解時間也能夠影響麥胚蛋白酶解，而對酶解影響最小的因素是pH和酶解溫度。通過分析正交結(jié)果得出最佳的酶解條件：底物濃度8%、酶解溫度55 ℃、pH 7.5、加酶量3000 U/g，酶解時間2 h。此時DPPH自由基清除率達88.91%±1.5%。

表1 正交試驗因素和水平表

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

2.3 酶解產(chǎn)物胚芽肽粗含量及抗氧化性測定

通過酶解條件的優(yōu)化，得到小麥胚芽的粗酶解液，通過540 nm吸光度的變化，測定酶解產(chǎn)物中多肽含量。通過一系列不同濃度標(biāo)品的測定，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.3645x+0.0023（R2=0.9986）。在540 nm下測得麥胚蛋白酶解后粗品水解液的吸光度，結(jié)果為0.470，此時的小麥胚芽肽的粗含量為1.28 mg/mL。

為探究麥胚蛋白的組成及抗氧化性能，采用葡聚糖凝膠層析法將麥胚蛋白粗酶解液進一步分離得到不同組分。通過葡聚糖凝膠G-50凝膠層析分離過濾后的上述麥胚蛋白酶解液，經(jīng)檢測得出3個分離峰，如圖3所示，將其分別標(biāo)記為組分1，組分2和組分3，測定每個組分的肽含量，并分別進行冷凍干燥，濃縮后測定其DPPH自由基清除率，結(jié)果如表3所示。組分2所含肽含量最高，約占60%，其DPPH自由基清除能力也最強，為77.74%±3.2%。而組分1和組分3的肽含量及其DPPH自由基清除能力相差不大，且均遠(yuǎn)低于組分2。

圖3 葡聚糖凝膠G50分離酶解粗產(chǎn)物

表3 3組分肽含量及DPPH自由基清除率測定

2.4 胚芽肽純化及抗氧化性分析

通過對酶解粗產(chǎn)物的初步分離，綜合肽含量和DPPH自由基清除率結(jié)果，將組分2繼續(xù)用葡聚糖凝膠G-25凝膠層析進一步分離純化。如圖4所示，組分2洗脫完畢，經(jīng)過檢測得到單一吸收峰，對其進行冷凍干燥，將濃縮后的組分定容至10 mL，測定其含量，為46.58%。將純化后的組分2用試劑盒對其總抗氧化能力、羥基自由基清除能力和抗超氧離子能力進行測定，結(jié)果如表4所示。經(jīng)過G-25凝膠層析分離純化后的樣品總抗氧化能力為0.511 mmol/L Trolox當(dāng)量，比純化前粗酶解品總抗氧化能力提高了1.69倍，此外，羥基自由基的清除能力和抗超氧自由基的能力分別56.45 U/mL和45.31 U/L，分別比粗酶解液提高了1.41和1.54倍。由此可見，純化后的蛋白各項抗氧化能力明顯比麥胚抗氧化肽粗品性能提高，這為提高小麥胚芽蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化能力奠定基礎(chǔ)，同時也為小麥胚芽產(chǎn)品抗氧化性能提高提供理論條件和經(jīng)驗。

圖4 葡聚糖凝膠G25分離純化組分2

表4 麥胚蛋白抗氧化肽的抗氧化能力

3 結(jié)論

試驗發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶水解麥胚蛋白的能力最強，通過單因素法和正交試驗方法優(yōu)化蛋白酶的工藝，優(yōu)化后的DPPH自由基清除率高達88.91%±1.5%，并測得酶解后得到1.28 mg/mL小麥胚芽肽。通過葡聚糖凝膠柱G-50凝膠層析對酶解產(chǎn)物初步分離，得到3種組分，對3種組分中DPPH自由基清除率最高的組分進一步采用葡聚糖G-25凝膠層析純化，得到單一組分，其純化后的總抗氧化能力提高了1.7倍，羥基自由基清除能力提高了1.4倍，抗超氧陰離子能力提高了1.5倍。后續(xù)可對酶解后的成分進行定性分析，確定成分組成，解析相關(guān)性質(zhì)，提高小麥胚芽的經(jīng)濟和實用價值。