陳曉蘭，蔡翔宇，鄧全道

1. 桂林海關(guān)（桂林 541004）；2. 南寧海關(guān)技術(shù)中心（南寧 530021）

羅漢果，系葫蘆科多年生滕本植物的果實，主要分布在我國廣西桂林地區(qū)，屬于當?shù)靥赜械慕?jīng)濟農(nóng)作物，也是當?shù)貍鹘y(tǒng)出口商品之一。阿維菌素屬于十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，由灰色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，天然阿維菌素包括8個組分，其中B1為主要活性成分。由于具有觸殺、胃毒作用及滲透力強等特點，阿維菌素被廣泛應(yīng)用于防治果樹、蔬菜、花卉等多種作物上的害蟲[2]。在羅漢果種植過程中，該農(nóng)藥也是用來防治各種病蟲害的首選。然而，按世界衛(wèi)生組織（WHO）五級分類標準，阿維菌素屬高毒化合物[3]，在農(nóng)產(chǎn)品上殘留量過高將直接影響人們的身體健康，甚至可能會引起食物中毒。為此，國內(nèi)外均對農(nóng)產(chǎn)品的阿維菌素殘留量有著嚴格的限量規(guī)定[4-7]。

關(guān)于阿維菌素殘留的檢測在農(nóng)產(chǎn)品及土壤上已有較多詳細的報道[8-14]。然而，應(yīng)用超高效液相色譜（UPLC）測定阿維菌素的文獻卻較少報道，尤其在羅漢果上更是未曾見有。此外，由于QuEChERS前處理技術(shù)[15]具有簡單、快速、有效、可靠及安全等特點，目前已被各實驗室廣泛應(yīng)用于農(nóng)食產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留分析[16-19]。因此，試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化QuEChERS基質(zhì)固相分散萃取的條件，考察樣品的基質(zhì)效應(yīng)，建立超高效液相色譜法測定羅漢果和土壤中阿維菌素的殘留量；在此基礎(chǔ)上應(yīng)用建立起來的分析方法，分別檢測阿維菌素在施藥后不同時間羅漢果和土壤中的殘留量，總結(jié)其消解動態(tài)規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；無水硫酸鎂（分析純，上海安譜實驗公司）：使用前在650 ℃下灼燒4 h；氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）：使用前用140 ℃烘烤4 h；石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺硅烷（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）：德國CNW公司；阿維菌素標準品（含量＞99%，德國Dr公司）：用甲醇溶解并定容，配制成1000 mg/L的標準儲備液，于4 ℃避光保存。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（Acquity UPLC型且配有電子紫外分光檢測器，美國Waters公司）；超純水設(shè)備（Milli-Q，美國Milipore公司）；渦旋器（OT-2A，上海琪特公司）；電子天平（瑞士Metler Toledo公司）；高速離心機（3K15，德國SIGMA公司）；均質(zhì)器（GT200，北京格瑞德曼公司）。

1.3 樣品檢測

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 羅漢果樣品

提取：準確稱取10.0 g試樣，加入20 mL乙腈，高速均質(zhì)器提取2 min，再加入2 g氯化鈉鹽析，渦旋混勻，以8000 r/min離心5 min，吸取全部上清液。加入3 g無水硫酸鎂于上清液中，渦旋混合，取出全部上清液，在35 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2 mL乙腈復溶，待凈化。

凈化：取1 mL復溶液于預先裝有50 mg PSA和50 mg C18的15 mL離心管中，渦旋混勻，以8000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，待UPLC測定。

1.3.1.2 土壤樣品

精確稱取5.0 g試樣（在分析樣品前先測定土壤的含水率）于離心管中，加入5 mL的超純水以及10 mL乙腈，超聲輔助提取15 min，再加入2 g氯化鈉鹽析，接下來的操作步驟同上述。

1.3.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm×1.7 μm，美國Waters公司）；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；檢測波長245 nm；流動相A為超純水，流動相B為乙腈，流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.3 純?nèi)軇藴嗜芤号c基質(zhì)匹配標準溶液的配制

分別用乙腈和基質(zhì)（羅漢果、土壤）空白對照液，稀釋配制成10 mg/L標準儲備液和基質(zhì)匹配標準儲備液，再各自逐級稀釋得到0.05，0.1，0.25，0.50，1.0，2.0和5.0 mg/L的標準系列，按1.3.2小節(jié)的條件測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)固相萃取填料的優(yōu)化

2.1.1 填料種類的選擇

QuEChERS前處理方法的顯著特點就是在凈化過程中使用各種固相萃取吸附填料，常用的有C18、PSA以及GCB等。C18主要用于除去試樣中脂溶性色素和脂肪等大部分非極性雜質(zhì)，PSA主要吸附基質(zhì)中的糖類和脂肪類等極性雜質(zhì)，而GCB則可以有效去除色素、甾醇類和非極性干擾物；與此同時，這些填料在去除基質(zhì)中雜質(zhì)的同時也有可能對目標化合物產(chǎn)生各種不同程度的吸附。因此，在前處理過程中，如何選擇合適的填料，達到既能去除雜質(zhì)從而降低基質(zhì)噪聲的干擾又能避免對目標化合物的過度吸附的效果，這才是關(guān)鍵。

分別將2 mL 200 μg/L阿維菌素純?nèi)軇藴嗜芤汉突|(zhì)匹配標準溶液，各自經(jīng)預裝有4種不同固相萃取填料進行吸附凈化處理，按1.3.2小節(jié)的條件測定，回收率結(jié)果見表2。純?nèi)軇藴嗜芤航?jīng)不同固相萃取填料處理后的色譜圖如圖1所示（阿維菌素出峰時間t=2.62 min）。

圖1 純?nèi)軇┌⒕S菌素標準溶液經(jīng)不同固相萃取填料處理后的色譜圖

從表2可見，阿維菌素經(jīng)GCB處理，回收率在5.0%左右，由此可見GCB對存在平面結(jié)構(gòu)的化合物阿維菌素產(chǎn)生了非常強烈的吸附；經(jīng)C18、PSA和C18+PSA分別處理，回收率分別為99.4%，87.7%和92.6%，由此可知C18對阿維菌素的吸附幾乎可以忽略不計，而PSA則有一定的吸附。與此同時，在進行基質(zhì)匹配標準溶液吸附試驗時，C18、PSA以及PSA+C18對阿維菌素均未產(chǎn)生明顯的吸附作用，回收率均顯著提高，這有可能是PSA中原本吸附阿維菌素的很多活性位點被基質(zhì)占據(jù)，從而減少了對目標物的吸附。此外，從肉眼可見，單獨使用C18或PSA時，凈化液均有一定的顏色，而使用PSA+C18時凈化液則澄清透明，這可能是因為兩者結(jié)合帶來的凈化效果更佳。以凈化效果以及回收率綜合考慮，故最終選擇PSA+C18組合作為固相萃取吸附填料來凈化提取液。

表2 阿維菌素經(jīng)不同固相萃取填料吸附凈化處理后的回收率

2.1.2 填料用量的優(yōu)化

固相萃取填料的用量也會對凈化效果產(chǎn)生影響，用量過少，基質(zhì)中的雜質(zhì)去除不徹底；用量過多，則會吸附目標物化合物，造成回收率損失。因此，通過考察25 mg C18+25 mg PSA，25 mg C18+50 mg PSA，50 mg C18+25 mg PSA，50 mg C18+50 mg PSA，50 mg C18+75 mg PSA，75 C18+50 mg PSA和100 mg C18+100 mg SA這7組不同用量的萃取填料分別對羅漢果和土壤中阿維菌素回收率的影響，從而選擇最優(yōu)的填料用量方案，結(jié)果如圖2所示。PSA+C18填料對雜質(zhì)的去除作用隨用量增加而增強，凈化效果越來越好，基質(zhì)噪音降低，回收率穩(wěn)步提升。但是，隨著填料進一步增加到一定程度，回收率變化不大甚至出現(xiàn)回落現(xiàn)象，很大的原因是過多的填料吸附了目標化合物。因此，綜合考慮回收率、凈化效果以及經(jīng)濟因素，最終確定50 mg C18+50 mg PSA為最佳的固相萃取填料選擇方案。

圖2 經(jīng)不同用量的萃取填料組合處理后對羅漢果和土壤中阿維菌素回收率的影響

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

在分析過程中，基質(zhì)效應(yīng)的存在會影響分析結(jié)果的準確度與精密度，干擾樣品目標物的定量分析。因此，在建立分析方法時，應(yīng)對基質(zhì)效應(yīng)進行評估，并采取適宜的方法消除或減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，從而確保測定結(jié)果的可靠性。

分別采用1.3.3小節(jié)配制好的純?nèi)軇藴嗜芤号c基質(zhì)匹配標準溶液系列制成的不同標準曲線，計算各自在同一個添加濃度水平下的回收率，通過兩者比值來評價基質(zhì)效應(yīng)。公式：|ME|=|（B-A）|（A和B分別為用純?nèi)軇藴是€和基質(zhì)匹配標準曲線各自計算目標物的回收率）。當|ME|≤10%時，表示基質(zhì)效應(yīng)較小，可用純?nèi)軇藴嗜芤呵€定量；當10%＜ |ME|≤50%時，表示基質(zhì)效應(yīng)較大，需用基質(zhì)匹配標準曲線定量以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

由表3可知：在0.01～0.5 mg/kg的添加水平下，用純?nèi)軇藴嗜芤呵€進行校正時，阿維菌素在羅漢果和土壤中的回收率范圍分別是57.6%～64.1%和65.6%～ 72.3%，基質(zhì)效應(yīng)|ME|分別是27.3～36.3和23.6～28.8，意味著基質(zhì)效應(yīng)較大，并且經(jīng)過基質(zhì)匹配標準溶液校正后得到較好的回收率，故試驗采用基質(zhì)匹配外標法進行校正定量。

表3 阿維菌素在羅漢果和土壤中的基質(zhì)效應(yīng)、平均回收率及精密度（n=6）

2.3 方法學驗證

2.3.1 方法的線性關(guān)系與檢出限

對1.3.3小節(jié)制備好的基質(zhì)匹配標準溶液系列進行分析，以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X），繪制回歸曲線。結(jié)果顯示，在0.05～5.0 mg/kg濃度范圍內(nèi)，羅漢果和土壤回歸方程的相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9946和0.9987，說明目標化合物組分在此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以滿足信噪比S/N≥3的最小添加水平作為方法的檢出限（Limits of detection，LOD），以滿足信噪比S/N≥10并且添加回收率的相對標準偏差[（Relative standard deviation，RSD，且n=6）]≤20%的最小加標水平作為定量限（Limits of quantitation，LOQ）。計算結(jié)果得知，阿維菌素在羅漢果基質(zhì)中的SLOD為2.3 μg/kg，SLOQ為7.2 μg/kg；土壤中的SLOD為3.1 μg/kg，SLOQ為9.5 μg/kg。

2.3.2 方法的回收率及精密度

取羅漢果和土壤空白樣品進行3個加標水平的回收率和精密度試驗，參考GB 2763—2019[10]關(guān)于食品中阿維菌素最大殘留限量的限定范圍，設(shè)定添加質(zhì)量濃度水平0.01，0.1和0.5 mg/kg，每個添加水平重復測定6次。由表3可知，羅漢果和土壤方法的平均回收率分別為84.9%～99.5%與89.2%～101.1%，相對標準偏差均小于10%。羅漢果或土壤空白及加標樣品色譜圖見圖3。

圖3 羅漢果或土壤空白及加標樣品色譜圖

2.4 實際樣品的測定

2.4.1 樣品的采集

在桂林羅漢果主產(chǎn)地臨桂縣的夏榴村基地，分別對羅漢果植株和土壤均勻噴施阿維菌素藥液（施藥劑量為30 g a. i./hm2）。各自于施藥后2 h及1，2，3，5，7，10，14和21 d采集羅漢果和土壤樣品，另設(shè)不施藥空白對照區(qū)。所有采集的樣品置于-18 ℃貯存，等待檢測。

2.4.2 殘留結(jié)果的測定

應(yīng)用所建方法測定施藥后不同時間點采集樣品中的阿維菌素殘留量，結(jié)果如表4所示。阿維菌素在羅漢果及土壤中的殘留量檢出范圍分別為0.029～0.305 mg/kg和0.092～0.984 mg/kg；消解過程均符合一級動力學方程，在羅漢果中的半衰期為1.9 d，在土壤中的半衰期為4.4 d。另外，從表4還可以看出，施藥后第7天阿維菌素在羅漢果上的降解率達到90%以上，施藥后10 d阿維菌素濃度降至＜0.01 mg/kg；施藥后第14天土壤中阿維菌素的降解率也在90%以上，施藥后21 d阿維菌素濃度降至＜0.01 mg/kg。由此可見，阿維菌素屬于易消解農(nóng)藥，而且在羅漢果中的消解速率比在土壤上較快一些。

表4 阿維菌素在羅漢果和土壤中的消解動態(tài)

3 結(jié)論與討論

此次研究以桂林特色農(nóng)產(chǎn)品羅漢果和土壤為試驗對象，以其種植過程中常用的農(nóng)藥阿維菌素為分析目標，確定50 mg C18+50 mg PSA作為最優(yōu)的固相萃取填料方案，建立起超高效液相色譜法測定羅漢果和土壤中的阿維菌素殘留量，用基質(zhì)匹配外標法進行校正。該方法在0.05～5.0 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，平均回收率在84.9%～101.1%之間，SRSD為3.1%～9.8%，SLOQ均小于0.01 mg/kg，符合農(nóng)藥殘留試驗準則的要求[21]；通過上述建立的方法檢測田間殘留試驗樣品，由結(jié)果得知，阿維菌素在羅漢果與土壤中的殘留量檢出范圍分別是0.029～0.305 mg/kg和0.092～ 0.984 mg/kg，均符合一級動力學消解方程，半衰期分別為1.9 d和4.4 d，并且分別在施藥后第10和第21天質(zhì)量濃度均降至＜0.01 mg/kg。由此可見，阿維菌素在羅漢果上的消解比在土壤上的速度快，對光熱照射敏感，屬于易消解農(nóng)藥（半衰期＜30 d）[22]。此次研究結(jié)果與阿維菌素在其他類似作物上的殘留動態(tài)基本一致，例如：范文靜等[12]研究得知阿維菌素在梨和土壤中的半衰期分別是1.3～3.0 d和1.2～3.7 d；李人杰等[23]試驗發(fā)現(xiàn)玉米植株和土壤中的半衰期分別是0.73～2.25 d和1.65～2.76 d。綜上所述，該檢測方法快速、準確、靈敏，完全可以滿足廣西桂林特色農(nóng)產(chǎn)品羅漢果及土壤中農(nóng)藥阿維菌素殘留監(jiān)測以及環(huán)境風險評價的技術(shù)要求。