倫明輝，杜薇，蔡哲，黃澤清

遼寧省腫瘤醫(yī)院中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院麻醉科，沈陽110042

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（POCD）是圍術(shù)期的嚴(yán)重并發(fā)癥，可導(dǎo)致患者康復(fù)延遲、醫(yī)療費(fèi)用增加，甚至病死率增高等，但其發(fā)生原因復(fù)雜［1］。糖尿病是POCD的第二大誘發(fā)因素［2］，糖尿病控制不佳也可致患者輕度認(rèn)知功能損害（MCI），臨床癥狀以學(xué)習(xí)和記憶能力下降為主［3］。七氟醚是目前臨床上常用的吸入性麻醉藥。多年來人們一直認(rèn)為麻醉藥的效應(yīng)隨其藥理作用消退而消失，一旦藥物消除，靶器官將恢復(fù)到以前的狀態(tài)，但越來越多的證據(jù)表明并非如此。最新研究［4］發(fā)現(xiàn)，TNF-α 具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)與大腦功能的作用，過多的TNF-α 表達(dá)可致認(rèn)知功能發(fā)生衰退。還有研究［5］發(fā)現(xiàn)，老年大鼠腹部切開縫合術(shù)后海馬組織中IL-1β mRNA 水平明顯增加，且在迷宮實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出認(rèn)知功能的靈活性受到影響。七氟醚對(duì)糖尿病模型大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力有何影響目前尚無定論。2020年5月-2020年11月，本研究觀察了七氟醚吸入對(duì)糖尿病模型大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 SPF 級(jí)雄性成年SD大鼠72 只，體質(zhì)量200～260 g，由遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心（遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司）提供，合格證號(hào)：NO. 211002300003081。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，維持室溫22～25 ℃，相對(duì)濕度65%～70%，自然晝夜光線，供給充足的飼料和水。七氟醚購(gòu)自日本丸石制藥株式會(huì)社（批號(hào)2222），鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自Sigma 公司。Accu-chek Active 血糖儀及試紙購(gòu)自Roche Diagnostics GmbH 公司，Datex Ohmeda 7100型麻醉機(jī)及Datex Ohmeda S/5 監(jiān)護(hù)儀購(gòu)自芬蘭Hel?sinki 公 司，PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司，Brilliant ⅢUltra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix 試劑 盒 購(gòu)自Agi?lent Technologies公司。

1.2 糖尿病模型大鼠的制備、分組及七氟醚吸入方法 48只SD大鼠給予腹腔內(nèi)注射STZ 53 mg/kg，注射后恢復(fù)正常進(jìn)食飲水，72 h后取靜脈血檢測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L 判定為糖尿病模型大鼠造模成功［6］。將糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為2組，即模型組和七氟醚組，每組24只。另24只正常SD大鼠，記為空白對(duì)照組。參照CULLEY 等［7］的方法對(duì)七氟醚組大鼠進(jìn)行3.4%七氟醚吸入麻醉干預(yù)3 h。模型組及空白對(duì)照組大鼠同期吸入30%氧氣3 h。

1.3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)空間學(xué)習(xí)和記憶能力評(píng)估 七氟醚吸入后第1 天和第3 天，每組隨機(jī)抽取12 只大鼠，采用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)［8］評(píng)估大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，包括定位航行實(shí)驗(yàn)、反轉(zhuǎn)空間探索實(shí)驗(yàn)。①定位航行實(shí)驗(yàn)。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)前6 d 行Morris 水迷宮定位航行訓(xùn)練，實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練過程中保持平臺(tái)位置不變。將大鼠由平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)放入水池，每次實(shí)驗(yàn)以120 s 為限，記錄動(dòng)物從入水點(diǎn)到達(dá)平臺(tái)所需時(shí)間。訓(xùn)練中若動(dòng)物在120 s 內(nèi)找到平臺(tái)，讓其在平臺(tái)上停留20 s；若動(dòng)物未能找到平臺(tái)，計(jì)算機(jī)停止跟蹤，記錄時(shí)間為120 s，將其放在平臺(tái)上使其停留20 s。每日上午、下午固定時(shí)間各訓(xùn)練一次，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，持續(xù)6 d。七氟醚吸入后第1天和第3天，記錄各組大鼠尋找到平臺(tái)時(shí)間，即為逃避潛伏期。②反轉(zhuǎn)空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后行反轉(zhuǎn)空間探索實(shí)驗(yàn)，即將平臺(tái)放在對(duì)側(cè)的象限，記錄大鼠入水后穿越原平臺(tái)位置次數(shù)及找到遷移后平臺(tái)潛伏期。Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即斷頭處死大鼠，分離取出海馬組織后立即放入液氮中冷卻，存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織中促炎因子IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 檢測(cè) 采用熒光定量PCR 法。取各組冷凍保存的海馬組織50 mg 放入研缽中，加入液氮迅速研磨，重復(fù)3 次；加入1 mL TRIzol 移入離心管中，室溫放置5 min；4 ℃條件下12 000×g離心10 min，取上清，加入200μL 氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min，4 ℃條件下12 000×g離心15 min。取無色上層水相400μL，加入500μL 異丙醇，顛倒10 次混勻，室溫放置10 min 使RNA 沉淀形成，4 ℃條件下12 000×g離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，吹打洗滌沉淀，4 ℃條件下7 500×g離心5 min，棄上清，空氣干燥至乙醇全部揮發(fā)；加入無RNA 酶水30μL 溶解RNA，核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA 濃度。取4 μL RNA 樣品稀釋25 倍，轉(zhuǎn)移至比色杯中，使用核酸蛋白分析儀檢測(cè)吸光度，記錄OD260和OD260/OD280值，計(jì)算RNA 濃度。使用Prime?Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用Stratagene Mx3000p熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR 反應(yīng)。使用Primer-BLAST 設(shè)計(jì)引物：IL-1β上游引物為5′-CAGCTTTCGACAGTGAGGAGA-3′，下 游 引 物 為5′-TGTCGAGATGCTGCTGTGAG-3′；TNF-α 上游引物為5′-ATGGGCTCCCTCTCATCAGT-3′，下 游 引 物 為5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′；以β-actin 為內(nèi)參，其上游引物為5′-CGCGAG?TACAACCTTCTTGC-3′，下游引物為5′-CGTCATC?CATGGCGAACTGG-3′。以2-ΔΔCt表 示 海 馬 組 織 中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較用單因素方差分析及LSD 多重檢驗(yàn)法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吸入七氟醚后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力比較 吸入七氟醚后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力比較見表1。由表1可知，與空白對(duì)照組、模型組和同組內(nèi)第3天相比，七氟醚組大鼠吸入七氟醚后第1天的空間學(xué)習(xí)和記憶能力均降低（P均<0.05）。

表1 吸入七氟醚后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力比較（x±s）

2.2 吸入七氟醚后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 吸入七氟醚后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較見表2。由表2可知，與空白對(duì)照組相比，模型組和七氟醚組大鼠海馬組織中吸入七氟醚后第1 天、第3 天IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 均升高（P均<0.05）；與模型組相比，七氟醚組大鼠海馬組織中吸入七氟醚后第1天、第3天IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 均升高（P均<0.05）；與同組內(nèi)第3天相比，七氟醚組大鼠海馬組織中吸入七氟醚后第1 天IL-1β mRNA、TNF-α mRNA均升高（P均<0.05）。

表2 吸入七氟醚后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠海馬組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）

3 討論

POCD 是一種病因復(fù)雜的圍術(shù)期嚴(yán)重并發(fā)癥。目前臨床研究［9］已經(jīng)證實(shí)，老齡是非心臟手術(shù)術(shù)后長(zhǎng)期POCD 的惟一獨(dú)立危險(xiǎn)因素。但除了老齡外，合并糖尿病患者可能因體內(nèi)自身代謝紊亂，在外源性應(yīng)激下更容易對(duì)大腦造成損害［10］。而且糖尿病是目前臨床上常見的慢性病之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，已達(dá)到了流行病的程度。臨床上糖尿病患者可能由于存在胰島素抵抗，而使胰島素的促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞突觸形成、增大胞體面積的作用減弱，進(jìn)而易致患者認(rèn)知功能受損，對(duì)外來刺激更加敏感。隨著對(duì)糖尿病的研究深入，越來越多的研究［11］表明，炎癥在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中起著不可低估的致病作用，而且有研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)和胰島素抵抗有著緊密的聯(lián)系。

不同研究者采用腹腔注射STZ 液50～60 mg/kg誘導(dǎo)建立糖尿病模型大鼠。本研究應(yīng)用腹腔注射STZ 液53 mg/kg，誘導(dǎo)72 h 后取尾靜脈血，檢測(cè)血糖均超過16.7 mmol/L，說明糖尿病模型大鼠造模成功。造模成功后約3 d 大鼠開始出現(xiàn)明顯多飲、多食、多尿癥狀；隨著高血糖持續(xù)，大鼠隨之逐漸出現(xiàn)毛色干枯發(fā)黃、精神萎靡等，其一般生理特征與臨床糖尿病患者癥狀和體征相似，符合糖尿病病理生理特征。有研究［12］顯示，腹腔注射STZ液55 mg/kg，造模成功后給予充足飼料和水飼養(yǎng)65 d后可形成糖尿病腦病模型，大鼠行為學(xué)測(cè)試學(xué)習(xí)和記憶能力顯著下降，解剖分離海馬組織并鏡下觀察到海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞大量死亡。本實(shí)驗(yàn)基于此文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果選擇STZ液誘導(dǎo)糖尿病造模成功后普通飼料飼養(yǎng)大鼠2 周后給予吸入麻醉干預(yù)，進(jìn)而評(píng)價(jià)大鼠獲取空間學(xué)習(xí)和記憶能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠Morris水迷宮測(cè)試逃避潛伏期、反轉(zhuǎn)空間探索實(shí)驗(yàn)穿越原平臺(tái)位置次數(shù)及找到遷移后平臺(tái)潛伏期與空白對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明STZ 誘導(dǎo)糖尿病大鼠2 周這單一處理因素并沒有影響其空間學(xué)習(xí)和記憶能力。七氟醚組吸入干預(yù)后第1 天大鼠的水迷宮定位航行測(cè)試逃避潛伏期與空白對(duì)照組比較延長(zhǎng)，反轉(zhuǎn)空間探索測(cè)試穿越原平臺(tái)次數(shù)減少，表明糖尿病模型大鼠行七氟醚吸入麻醉干預(yù)后第1 天其獲取空間學(xué)習(xí)能力受到影響；七氟醚組吸入干預(yù)后第1天大鼠的反轉(zhuǎn)空間探索測(cè)試尋找到遷移后平臺(tái)潛伏期與空白對(duì)照組比較延長(zhǎng)，表明大鼠其獲取空間的再學(xué)習(xí)能力也受到影響。本研究還發(fā)現(xiàn)，七氟醚組吸入干預(yù)后第3 天大鼠的各項(xiàng)水迷宮測(cè)試成績(jī)與空白對(duì)照組比較無明顯差異，表明吸入麻醉干預(yù)后第3天大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力無明顯改變。

POCD 發(fā)病機(jī)制不明，近年來許多基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)可能與乙酰膽堿含量減少、S100β 蛋白表達(dá)增高、tau 蛋白過度磷酸化、β 淀粉樣蛋白沉積增加或中樞炎癥反應(yīng)相關(guān)。中樞系統(tǒng)促炎因子TNF-α、IL-1β 協(xié)同作用下啟動(dòng)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞不斷聚集，最終導(dǎo)致組織器官損傷。BARRIENTOS 等［13］研究也發(fā)現(xiàn)，對(duì)老齡大鼠腦室內(nèi)注射IL-1 受體拮抗劑能夠有效預(yù)防老齡大鼠POCD 和神經(jīng)炎癥的發(fā)生。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［14］顯示，鞘外注射LPS 激活外周免疫系統(tǒng)能夠引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥如IL-1、IL-6 和TNF-α 等促炎因子的增高，后者可能通過直接（外周促炎因子通過激活的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制直接滲透過血腦屏障）或間接（促炎因子通過刺激迷走神經(jīng)）的機(jī)制而影響認(rèn)知功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組、七氟醚組大鼠促炎因子IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 的相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組均增加。但在七氟醚吸入干預(yù)后第3 天其mRNA 表達(dá)呈下降趨勢(shì)，但仍高于空白對(duì)照組水平。IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 表達(dá)趨勢(shì)與各組大鼠Morris 水迷宮測(cè)試成績(jī)趨勢(shì)相一致。各組大鼠海馬組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 相對(duì)于空白對(duì)照組表達(dá)量均有增加且七氟醚組吸入干預(yù)后第1 天增加量最多，但Morris 水迷宮測(cè)試成績(jī)只有七氟醚組吸入干預(yù)后第1 天有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，據(jù)此推測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)升高只有達(dá)到一定程度可能才表現(xiàn)出行為學(xué)的改變。

綜上所述，七氟醚吸入可致糖尿病模型大鼠出現(xiàn)早期空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降，但這種影響是可逆的，其機(jī)制可能與大鼠海馬組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA的表達(dá)升高有關(guān)。