賴揚(yáng)帆，王鵬，喬里，劉中靜，葉朝陽，梁燕

1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙體牙髓科，貴州 貴陽（550004）；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，貴州 貴陽（550004）

作為人類口腔中的主要致齲菌，變異鏈球菌大量繁殖形成牙菌斑生物膜附著在牙齒表面，其代謝形成局部酸環(huán)境長期作用于牙齒導(dǎo)致其脫礦，進(jìn)而發(fā)生齲病［1］。目前對于變異鏈球菌基因功能研究仍主要集中在與其致齲性相關(guān)的生物膜形成、產(chǎn)酸耐酸“毒力因子”及其調(diào)控基因方面，如直接毒力侵染因子糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferases，GTFs）和葡聚糖結(jié)合蛋白（glucna-binding proteins，GBPs）。SMU.833糖基轉(zhuǎn)移酶通過影響葡聚糖合成進(jìn)而影響生物膜形成［2］，SMU.940則調(diào)控葡聚糖結(jié)合蛋白C表達(dá)來影響生物膜形成［3-4］。變異鏈球菌胞壁（被膜）相關(guān)基因不僅可調(diào)控胞壁生物合成、細(xì)菌生長、分裂繁殖，也間接與致齲生物膜形成、產(chǎn)酸耐酸密切相關(guān)，如編碼鼠李糖-葡萄糖胞壁多糖合成酶（rhamnose-glucose polysaccharide G，rgpG），編碼生物膜調(diào)控蛋白（biofilm regulatory protein A，brpA）和編碼青霉素結(jié)合蛋白5合成抑制蛋白（penicillin-sensitive repressor protein，psr）基因，當(dāng)三者同時(shí)突變時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)株相比，三缺陷菌（rgpG/brpA/psr）不僅顯著降低生長速率，還加劇菌體分裂“紊亂”形態(tài)（“短桿狀”菌體“腫脹”變大，出現(xiàn)多重非對稱中間隔），嚴(yán)重影響生物膜形成［5］。

變異鏈球菌基因組中，hit基因編碼HIT家族蛋白SMU.412c，且該基因與brpA（lytR）基因鄰近［6］。同時(shí)，生物信息學(xué)分析表明，HIT家族蛋白廣泛存在于原核生物、真核生物、哺乳類動(dòng)物，而且高度保守，具有重要生理功能［7］。hit基因是否可以調(diào)控變異鏈球菌增殖及生長周期尚不清楚。本研究利用基因同源重組方法敲除變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株hit基因片段，構(gòu)建hit基因缺陷菌株，為后續(xù)研究變異鏈球菌hit基因與上述brpA、psr和rgpG等基因間互相作用，及其在變異鏈球菌生長繁殖以及生物膜形成、產(chǎn)酸耐酸等致齲性方面研究提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑

BHI（brain heart infusion）培養(yǎng)基（杭州百思生物技術(shù)有限公司，中國）；LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基（OXOID公司，英國）；壯觀霉素（上海生工生物工程股份有限公司，中國）；十六烷基三甲基溴化銨（北京索萊寶科技有限公司，中國）；限制性內(nèi)切酶［寶生物技術(shù)（大連）有限公司，中國］；質(zhì)粒小提試劑盒（北京天根生化科技有限公司，中國）；普通DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司，中國）；DNA maker（北京全式金生物技術(shù)有限公司，中國）；厭氧產(chǎn)氣袋（三菱集團(tuán)，日本）；質(zhì)粒pFW5（上海滬震公司，中國）；變異鏈球菌ATCC25175（NCTC10449）標(biāo)準(zhǔn)株（北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，中國）。

1.2 菌株及培養(yǎng)條件

變異鏈球菌ATCC25175（NCTC10449）標(biāo)準(zhǔn)株（類型：Streptococcus mutansClarke，來源：牙本質(zhì)齲）培養(yǎng)條件：①培養(yǎng)基是BHI腦心浸出液肉湯，3.7 g/100 mL液體或1%瓊脂粉培養(yǎng)基，按121℃/0.1 MPa滅菌20 min；②37℃，厭氧孵育，靜置（或小搖床200 rpm）培養(yǎng)24～48 h。

大腸桿菌感受態(tài)DH5α（本實(shí)驗(yàn)室保存菌種）培養(yǎng)條件：①培養(yǎng)基：LB液體或1%（w/v）瓊脂固體培養(yǎng)基；②37℃孵育靜置（或小搖床220 rpm）培養(yǎng)過夜。

1.3 變異鏈球菌全基因組DNA提取

取變異鏈球菌ATCC25175甘油菌種，室溫復(fù)蘇，劃線接種于BHI固體培養(yǎng)板，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，挑取單克隆菌斑，接種于BHI液體培養(yǎng)基，24 h后取出，菌液離心后收集菌體，用CTAB法提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因擴(kuò)增引物

變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株基因組全序：NCBI Reference Sequence：NZ_LS483349.1，大小為2 019 343 bp），其hit基因大小為420 bp；本課題研究hit基因上下游序列范圍為：1664202～1665870，大小為1 669 bp。質(zhì)粒載體pFW5序列：GenBank，ACCESSION：U41082，大小為2 726 bp［8］，由上海滬震公司提供測序報(bào)告，利用生物軟件Primer Premier 5.00設(shè)計(jì)相關(guān)PCR擴(kuò)增引物序列，如表1所示。以提取的變異鏈球菌基因組DNA為模板，配制PCR反應(yīng)擴(kuò)增液，進(jìn)行PCR反應(yīng)，然后用1%（wt/vol）瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5 重組質(zhì)粒pFW5（hit-Up-pFW5-Down）構(gòu)建

配制雙酶切反應(yīng)液，將hit基因上游片段與載體pFW5質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，37℃酶切反應(yīng)3～6 h，酶切產(chǎn)物使用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，再分別檢測pFW5質(zhì)粒與hit上游片段雙酶切后的濃度。

根據(jù)T4 DNA Ligase產(chǎn)品說明書，配置pFW5質(zhì)粒與hit基因上游片段連接反應(yīng)液。連接后的產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Spe+（0.1 mg/mL）抗性LB固體培養(yǎng)基圓板，37℃倒置靜置過夜培養(yǎng)，提取陽性單克隆菌斑質(zhì)粒。同樣的方法再將hit基因下游片段插入已構(gòu)建好的質(zhì)粒中，獲得hit基因缺陷重組質(zhì)粒（編號為20#和141#）。在pFW5載體的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS-I和MCS-II）前后，設(shè)計(jì)了pFW5（PCR）兩對引物（pFW5-F/pFW5-R1和pFW5-F1/pFW5-R，見表1），對20#、141#及對照空質(zhì)粒pFW5進(jìn)行PCR擴(kuò)增雙酶切鑒定，挑選出正確大小的質(zhì)粒送檢測序。測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Blast對比拼接。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列Table 1 Primers and sequences used in the experiment

1.6 變異鏈球菌hit基因缺陷菌株的構(gòu)建

選取變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株單克隆菌斑接種入BHI液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，抽取100μL菌液接種至2 mL BHI液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，取300μL上述菌液加入2.4μL濃度為1 mg/mL的感受態(tài)刺激肽CSP溶液［9］，輕輕混勻，孵育0.5 h。

將單酶切線性化純化后的hit-Up-pFW5-Down質(zhì)粒4μg加入到上述菌液中，輕輕搖晃培養(yǎng)3 h后將菌液涂布于Spe+（0.1 mg/mL）抗性的BHI培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h。選取陽性單克隆菌斑，用CTAB法提取基因組，送檢測序。

1.7 變異鏈球菌hit基因缺陷菌株遺傳穩(wěn)定性

將構(gòu)建成功的變異鏈球菌hit基因缺陷菌株提高壯觀霉素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1 mg/mL）后多次傳代，提取基因組DNA，再次送檢測序。

1.8 變異鏈球菌hit基因缺陷菌株生長曲線測定

①甘油菌種經(jīng)BHI固體培養(yǎng)基劃線活化后，挑選單克隆菌斑接種于BHI液體培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng)約20 h；取部分種子菌液，用無抗BHI培養(yǎng)基稀釋到0.5麥?zhǔn)媳葷釢舛龋缓笙♂?00倍為工作菌液［（1～2）×106CFU/mL］。②取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，其中每孔加入180μL無抗BHI培養(yǎng)基和20μL工作菌液，厭氧培養(yǎng)，監(jiān)測其在48 h內(nèi)OD600值變化。設(shè)置三組平行實(shí)驗(yàn)，變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行生長對照。生長速率計(jì)算方法：生長速率=［（OD600）t-（OD600）0］/t。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料服從正態(tài)分布，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hit基因上下游片段擴(kuò)增

以變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板，分別利用hit上下游引物對，擴(kuò)增hit基因上下游片段，hit上游片段大小為850 bp，下游片段大小為519 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)核酸電泳鑒定，hit基因上下游擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一明亮條帶，大小與預(yù)計(jì)大小相近（圖1a）。質(zhì)粒載體pFW5有上下兩個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS-I和MCS-II），兩者被壯觀霉素抗性基因aad9所分隔開（圖1b）。

Figure 1 Electrophoresis of PCR products of the upstream and downstream sequences of the hit gene and the circle map of the pFW5 vector圖1 hit基因上游、下游片段PCR產(chǎn)物電泳和pFW5載體圖

2.2 pFW5重組質(zhì)粒構(gòu)建

重組質(zhì)粒20#和141#PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖2a所示。在MCS-Ⅰ區(qū)插入hit基因上游片段部分PCR產(chǎn)物大小為1 774 bp；在MCS-Ⅱ區(qū)插入hit基因下游部分PCR產(chǎn)物為1 078 bp，其對應(yīng)空載體pFW5為935 bp和571 bp，表明重組質(zhì)粒上游部分插入約800 bp的hit基因上游片段和約500 bp的hit基因下游片段。

重組質(zhì)粒20#和141#樣品經(jīng)XhoI和SpeI雙酶切后電泳鑒定，未經(jīng)酶切的空載體pFW5可見一條大小約2 700 bp明亮條帶，與空載體大小相同；空載體pFW5經(jīng)XhoI和SpeI雙酶切后，兩條帶大小分別約為1 500 bp和1 100 bp，符合預(yù)期大?。恢亟M質(zhì)粒20#、141#經(jīng)過雙酶切后呈現(xiàn)兩條清晰的條帶，大小分別約為1 500 bp和2 500 bp，如圖2b所示。

2.3 hit-Up-pFW5-Down重組質(zhì)粒測序

為了精準(zhǔn)確定重組質(zhì)?？寺?gòu)建，將pFW5（hit-Up-pFW5-Down）重組質(zhì)粒20#、141#送公司測序，并將樣本測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫里進(jìn)行BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比 對和拼接。對比顯示：上下游片段成功插入pFW5載體的MCS-I和MCS-II區(qū)間。變異鏈球菌hit基因缺陷重組質(zhì)粒的連接順序?yàn)椋篽it基因上游片段、Spe+抗性基因、hit基因下游片段，以上片段以正確序列與pFW5質(zhì)粒連接構(gòu)成基因缺陷質(zhì)粒。

2.4 變異鏈球菌hit基因缺陷菌株篩選

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入變異鏈球菌后隨機(jī)選取陽性單克隆菌斑若干，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR克隆鑒定，如圖3所示。hit基因片段的PCR產(chǎn)物樣本電泳圖中，都出現(xiàn)大小一致明暗不同的兩條帶，分別約為1 400 bp和550 bp，提示pFW5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株后，部分與標(biāo)準(zhǔn)株本身hit基因?qū)崿F(xiàn)同源重組；同時(shí)，也存在轉(zhuǎn)入未被線性化重組質(zhì)粒而又未實(shí)現(xiàn)同源重組菌株（菌斑顯陽性，550 bp條帶明亮），如20-8、20-9樣本。

Figure 2 Electrophoresis of PCR-and double digested-products of the recombinant plasmid pFW5圖2 重組質(zhì)粒pFW5的PCR產(chǎn)物與其雙酶切產(chǎn)物電泳

Figure 3 DNA electrophoresis of PCR products of the hit gene DNA fragments from the Streptococcus mutans genome of plasmid(20#)genetic transformation圖3 質(zhì)粒（20#）遺傳轉(zhuǎn)化變異鏈球菌株基因組的hit基因片段PCR產(chǎn)物核酸電泳

選擇hit基因條帶（550 bp）較弱或無該條帶的樣 品，如20-3#、20-5#等，并 對 照 變 異 鏈 球 菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株，進(jìn)行hit基因片段PCR產(chǎn)物測序，其電泳條帶和Sanger測序如圖4所示。hit基因片段的PCR產(chǎn)物大小約為1 400 bp（圖4a），而沒有出現(xiàn)模式菌株ATCC25175大小約為550 bp的條帶（圖4c），表明原有的hit基因片段里都已插入了長達(dá)近900 bp堿基片段。PCR產(chǎn)物Sanger測序，正向測序讀圖顯示：hit基因殘余堿基序列片段堿基C（圖4b，雙箭頭）后，緊接堿基序列片段的堿基A，該序列與載體pFW5上連接aad9壯觀霉素抗性基因的連接序列相同，與相應(yīng)位置處正常hit基因堿基序列明顯對照（圖4b，雙箭頭右側(cè)部分）。

反向測序讀圖顯示：hit基因殘余堿基序列堿基C（圖4d，雙箭頭）前，緊靠堿基序列堿基G，該序列與載體pFW5上連接aad9壯觀霉素抗性基因的連接序列相同，也與對應(yīng)位置處正常hit基因堿基序列明顯對照（圖4d，雙箭頭左側(cè)部分），表明變異鏈球菌hit基因缺陷菌株構(gòu)建成功。

2.5 變異鏈球菌hit基因缺陷菌株遺傳穩(wěn)定篩選

Figure 4 Electrophoresis and Sanger sequencing of PCR products of the hit gene fragment from the hit-deficient mutant strains and their parental S.mutans ATCC25175圖4 變異鏈球菌hit基因缺陷突變菌株及其標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25175的hit基因片段PCR產(chǎn)物電泳和Sanger測序圖

將圖3中的樣品進(jìn)行多次抗性篩選和鑒定，篩選后的缺陷菌株基因組的hit基因片段PCR產(chǎn)物電泳和Sanger測序，如圖5所示。PCR產(chǎn)物電泳只有單一大小約1 400 bp條帶（圖5a）。PCR產(chǎn)物Sanger測序，正向測序顯示：hit基因殘余堿基序列堿基C（圖5b，粗黑箭頭）后，緊接堿基序列的堿基A，該序列為載體pFW5上連接aad9壯觀霉素抗性基因的連接序列；反向測序顯示：hit基因殘余堿基序列堿基C（圖5c，粗黑箭頭）前，緊靠堿基序列堿基G，該序列也是載體pFW5上連接aad9壯觀霉素抗性基因的連接序列，都與之前初篩時(shí)的Sanger測序結(jié)果相一致，表明獲得遺傳穩(wěn)定hit基因缺陷變異鏈球突變菌株。

2.6 變異鏈球菌hit基因調(diào)控細(xì)菌生長周期

hit基因缺陷型變異鏈球突變菌株（Smu.Δhit）生長普遍都要比變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株更快速（圖6）：Smu.Δhit缺陷菌株遲緩期從15 h縮短到5 h左右；Smu.Δhit缺陷菌株進(jìn)入對數(shù)期持續(xù)快速生長約12 h后，ATCC25175才開始從遲緩期進(jìn)入對數(shù)生長期，持續(xù)快速生長約12 h后到達(dá)峰值，逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)生長速率開始下降，呈現(xiàn)比較典型細(xì)菌生長周期特征。而Smu.Δhit缺陷菌株在進(jìn)入對數(shù)期持續(xù)快速生長約12 h后，生長速率出現(xiàn)較明顯波動(dòng)，約4 h后也達(dá)到其生長速率峰值，比較ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株提前約4 h進(jìn)入生長速率下降的穩(wěn)定期。從整個(gè)生長周期看來，Smu.Δhit缺陷菌株生長速率都要明顯高于標(biāo)準(zhǔn)菌株Smu.25175（P＜0.001），表明變異鏈球菌hit基因調(diào)控細(xì)菌生長周期。

3 討論

本課題組利用基因同源重組方法，構(gòu)建變異鏈球菌hit基因缺陷突變菌株，在BHI培養(yǎng)基中，hit基因缺陷變異鏈球菌株整個(gè)生長周期普遍比變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株更為快速，初步證實(shí)了GenBank注釋所推測的調(diào)控細(xì)胞周期功能。

Figure 5 Electrophoresis and Sanger sequencing chromatograms of the PCR products of the hit gene DNA fragments from the hitdeficient mutant strains圖5 遺傳穩(wěn)定hit基因缺陷變鏈突變菌株的hit基因片段PCR產(chǎn)物電泳和Sanger測序讀圖

Figure 6 Growth curve and growth rate of the hit-deficient mutant strains versus Streptococcus mutans圖6 hit基因缺陷型變異鏈球突變菌株和標(biāo)準(zhǔn)株生長曲線和生長速率曲線

在ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株基因組全序中hit基因彼鄰brgA（lytR）基因（通過調(diào)控自溶素酶表達(dá)來控制細(xì)菌生長周期［10］）和ABC（ATP-Binding Cassette）相關(guān)基因，他們可能會(huì)組成一個(gè)“調(diào)控基因簇”，hit基因調(diào)控lytR（brgA）轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。hit基因突變菌株成功構(gòu)建，為hit基因在細(xì)菌生長繁殖致生物膜形成、產(chǎn)酸耐酸致齲性方面的研究提供條件。

細(xì)菌為適應(yīng)環(huán)境變化，具有從環(huán)境中吸收和整合外源游離DNA的“天然遺傳轉(zhuǎn)化”機(jī)制，以獲得新基因或新遺傳性狀，促進(jìn)細(xì)菌抗抗生素和遺傳變異的出現(xiàn)以及毒力因子快速進(jìn)化［11-13］。這在鏈球菌中也廣泛存在，如變異鏈球菌、唾液鏈球菌和肺炎鏈球菌中的“ComCDE基因簇”群體感應(yīng)系統(tǒng)［14-15］。鏈球菌通過群體感應(yīng)系統(tǒng)來誘導(dǎo)其進(jìn)入遺傳感受狀態(tài)，主要是依賴于感受態(tài)刺激肽信號系統(tǒng)［16-17］。環(huán)境變化對其天然轉(zhuǎn)化感受態(tài)產(chǎn)生巨大影響，細(xì)菌產(chǎn)生和分泌CSP信息素的能力也與轉(zhuǎn)化效率相關(guān)，使用人工合成CSP可以避免細(xì)菌生產(chǎn)和分泌內(nèi)源性CSP所需要的苛刻條件，人工合成CSP加入將轉(zhuǎn)化效率提高了幾個(gè)數(shù)量級，即使在野生型菌株中也是如此，擴(kuò)大了可轉(zhuǎn)化的菌株范圍，在突變體構(gòu)建中則可利用這一特性［18］。利用人工合成變異鏈球菌ATCC25175標(biāo)準(zhǔn)株刺激肽CSP（GenBank：SQF47995.1）成熟肽，誘導(dǎo)變異鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)入遺傳感受狀態(tài)，利用該天然轉(zhuǎn)化方法成功地使重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)株內(nèi)進(jìn)行同源重組，獲得hit基因缺陷突變菌株。這與目前常用的電轉(zhuǎn)化方法相比具有明顯優(yōu)勢：無需專用電轉(zhuǎn)儀，簡單方便有效又不電擊損傷變異鏈球菌體。本研究為深入了解變異鏈球菌hit基因功能及致齲性提供了基礎(chǔ)。

【Author contributions】 Lai YF，Liang Y wrote the article.Lai YF，Wang P，Liu ZJ and Qiao L performed the experiments.Ye ZY designed the study，analyzed the data and revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.