張倩，陳斌，閆福華

1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，南京市口腔醫(yī)院兒童口腔科，江蘇 南京（210008）；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，南京市口腔醫(yī)院牙周病科，江蘇 南京（210008）

牙周炎是人類最常見的口腔疾病之一，慢性牙周炎發(fā)病率高、早期癥狀不明顯，不易引起重視，而當(dāng)出現(xiàn)牙齒松動、疼痛等癥狀時，已發(fā)展為重度牙周炎，可致牙齒松動、脫落，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量［1-3］。因此，對牙周組織破壞進行早期診斷、判斷牙周基礎(chǔ)治療的療效和牙周炎的預(yù)后具有重要意義。牙菌斑是牙周炎的始動因子，但是宿主的免疫反應(yīng)決定了牙周組織破壞的進程。齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）作為一種牙周的局部滲出液，一定程度上可以反映宿主的免疫反應(yīng)。由于GCF收集方法簡單且無創(chuàng)，采用GCF作為牙周炎早期診斷或預(yù)測牙周組織破壞的指標(biāo)，具有非常良好的應(yīng)用前景。雖然已有關(guān)于不同牙周狀態(tài)下GCF中細(xì)胞因子水平的相關(guān)研究［4-6］，但目前國內(nèi)尚無在牙周基礎(chǔ)治療后隨訪期間出現(xiàn)牙周炎進展的位點GCF中進行細(xì)胞因子檢測的研究。GCF成分眾多，本研究選取了與牙周組織破壞有關(guān)的2種常見促炎因子——腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin 6，IL-6），抗炎因子白細(xì)胞介素10（interleukin 10，IL-10），在骨代謝中發(fā)揮重要作用的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP），觀察重度慢性牙周炎患者治療前后GCF中以上4種生物標(biāo)志物水平，探討GCF中生物標(biāo)志物水平對于判斷牙周基礎(chǔ)治療的療效和隨訪期間局部出現(xiàn)牙周炎進展的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

本項研究經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2013NL-007），并在中國臨床試驗中心注冊（注冊號：ChiCTR-OCH-13004679），所有受試者在進入研究前均對本研究知情同意并簽署了知情同意書。

選擇就診于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周病科的患者，根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，有30例患者（男性11例，女性19例，年齡40～56歲）參與并完成了這項2015年12月～2016年12月為期1年的縱向試驗研究。

依據(jù)1999年牙周病分類標(biāo)準(zhǔn)［7］，納入標(biāo)準(zhǔn)：①40歲及以上年齡、至少有14顆可評估的牙（其中有4顆磨牙）；②全身健康無系統(tǒng)性疾病，無吸煙史，婦女未妊娠；③至少3個月內(nèi)未使用過抗生素；④1年內(nèi)無牙周治療史；⑤全口1/3以上的患牙滿足以下條件：牙周支持組織的破壞超過根長1/3；Ⅱ度或Ⅲ度根分叉病變；探診深度（probing depth，PD）>6 mm；臨床附著喪失（clinical attachment loss，CAL）≥5 mm。

同時招募了15例牙周健康志愿者作為重度慢性牙周炎患者基線時的對照（男性6例，女性9例，年齡22～35歲，無全身系統(tǒng)性疾病，無吸煙史，PD＜3 mm，沒有附著喪失和牙槽骨吸收，全口探診出血陽性位點≤20%）。

1.2 基線牙周臨床檢查、齦溝液的收集

對參與者進行初步的牙周檢查，僅包括菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）、牙齒松動度和影像學(xué)檢查（全景片或錐形束CT）［8］。根據(jù)齦緣位置和影像學(xué)檢查顯示的牙槽骨位置預(yù)估慢性牙周炎患者的PD，對預(yù)估PD≥6 mm（深袋）和PD≤4 mm（淺袋）的位點采集GCF，以避免探診后采樣導(dǎo)致牙周袋內(nèi)GCF被干擾，從而獲得相對真實的結(jié)果。

取樣之前，用棉卷隔濕，然后使用無菌刮匙刮除齦上菌斑，氣槍輕輕吹干后，將尺寸為2 mm×8 mm的無菌濾紙（Whatman，美國）放入牙周袋中，直到感到阻力為止，30 s后取出［7］。然后將濾紙條放入預(yù)先稱重的無菌Eppendorf管中。如果濾紙被血液或唾液污染，則將其丟棄并選擇另一個位點。2 min后，再次使用相同的方法從相同的位置收集GCF，并將試紙條放入相同的試管中。所有GCF樣品均由同一人收集。使用精密電子天平（Mettler-Toledo，XS205，梅特勒-托利多，中國）稱取采樣前后濾紙的重量，兩次的重量差就是GCF的重量，以齦溝液的比重為1 mg/μL計算GCF的體積。將樣品密封并保存在-80℃待檢。

待采樣結(jié)束再使用牙周探針（Hu-Friedy，美國）測量并記錄齦溝出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）、PD、CAL［8］，當(dāng)實際也滿足6 mm≤PD≤9 mm或PD≤4 mm時將該樣本納入研究，反之則剔除。最終每例患者收集2個深袋位點和2個淺袋位點納入研究。所有臨床檢查均由同一位經(jīng)驗豐富的牙周病專科醫(yī)生進行。以相同的方式收集并保存了15名牙周健康志愿者中30個健康牙位的GCF。

1.3 牙周基礎(chǔ)治療及牙周臨床指標(biāo)測量

在基線GCF采樣和牙周臨床指標(biāo)記錄后，每例患者均接受了由同一位經(jīng)驗豐富的牙周病?？漆t(yī)生進行操作的牙周基礎(chǔ)治療，包括口腔衛(wèi)生宣教、齦上潔治、全口齦下刮治和根面平整。在基礎(chǔ)治療后1、3、6和12個月隨訪時，對每例患者進行重新評估，記錄數(shù)據(jù)，按照上述方法取同樣牙位的GCF，-80℃冰箱保存待檢。隨訪治療主要包括有針對性的強化口腔衛(wèi)生指導(dǎo)、齦上潔治，2次隨訪期間CAL增加≥2 mm的位點被認(rèn)為是牙周炎活動期位點，即這些位點出現(xiàn)了牙周炎進展，對這些位點需要再次進行齦下刮治。

1.4 GCF中IL-6、IL-10、TNF-α、ALP水平的檢測

將收集到的樣品在同一日檢測。檢測當(dāng)天，將Eppendorf管中的GCF樣品在室溫下融化，并在搖床上以150 rpm的轉(zhuǎn)速用500μL去離子水洗脫1 h，10 000 rpm轉(zhuǎn)速離心10 min后，去除上清液。

用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）（IL-6、IL-10、TNF-α試劑盒購于美國R＆D公司；ALP試劑盒購于美國Cloud-Clone公司）檢測齦溝液中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP含量，嚴(yán)格參照試劑盒說明書進行操作。試劑盒中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP的平均最低可檢測劑量分別為0.039 pg/mL、0.063 pg/mL、0.049 pg/mL和1.27 ng/mL。如果某位點的生物標(biāo)志物水平測出來低于最低值，則認(rèn)為該位點水平不可測，剔除該位點。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算生物標(biāo)志物的濃度，然后乘以體積就是該生物標(biāo)志物的水平，計算為pg/牙位。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

使用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0中文版分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5做圖。使用Wilcoxon符號秩和檢驗比較基線時和治療后1、3、6和12個月時GCF中牙周臨床指標(biāo)和生物標(biāo)志物水平的組內(nèi)比較，Mann-WhitneyU檢驗比較兩組之間牙周臨床指標(biāo)以及GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平的差異。GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平與牙周臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線期重度慢性牙周炎患者不同位點、健康對照者GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平

基線期重度慢性牙周炎患者未經(jīng)治療的牙周炎位點GCF中IL-6、TNF-α、ALP水平顯著高于對照組牙周健康者的位點（P＜0.001），IL-10水平顯著低于對照組（P＜0.001）。此外，重度慢性牙周炎患者深袋位點的GCF中TNF-α、ALP、IL-6水平顯著高于淺袋位點（P<0.001），IL-10水平顯著低于淺袋位點（P<0.001）（表1）。

2.2 基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個月重度慢性牙周炎患者不同位點GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP水平和臨床指標(biāo)

2.2.1 生物標(biāo)志物水平 牙周基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個月，與基線期相比，重度慢性牙周炎患者淺袋、深袋位點GCF中的TNF-α、ALP水平顯著降低，IL-10水平顯著升高（P＜0.005），但是IL-6水平只在深袋位點GCF中顯著降低（P＜0.005），淺袋位點的IL-6水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。

表1 基線期重度慢性牙周炎患者牙周炎位點和對照組健康位點GCF中生物標(biāo)志物的水平Table 1 Levels of biomarkers in GCFat periodontitis sites in patients with severe chronic periodontitis at baseline and healthy sites in the control group Median(IQR)

Figure 1 Levels of IL-6,TNF-α,IL-10,and ALP in the GCF of deep-pocket and shallow-pocket sites at the baseline and 1,3,6 and 12 months after nonsurgical periodontal therapy圖1 基線及牙周基礎(chǔ)治療1、3、6、12個月深袋、淺袋位點GCF中IL-6、IL-10、TNF-α和ALP的水平

2.2.2 臨床牙周指標(biāo) 牙周基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個月，重度慢性牙周炎患者深袋和淺袋位點的PD和CAL與基線相比，明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.005）。深袋位點的PLI和SBI與基線相比，基礎(chǔ)治療后明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.005）；淺袋位點的PLI和SBI，治療后有一定下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖2）。

Figure 2 Clinical indicators of deep pocket and shallow pocket sites at the baseline and 1,3,6 and 12 months after nonsurgical periodontal therapy圖2 基線及牙周基礎(chǔ)治療1、3、6、12個月深袋、淺袋位點的臨床指標(biāo)

2.3 GCF中生物標(biāo)志物水平與牙周臨床指標(biāo)之間的相關(guān)性

GCF中IL-6、TNF-α水平和ALP與牙周臨床指標(biāo)（PD、CAL、PI、SBI）間存在有統(tǒng)計學(xué)意義的正相關(guān)（P<0.05），而IL-10水平與牙周臨床指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），具體相關(guān)系數(shù)及P值見表2。其中GCF中4種生物標(biāo)志物水平與PD、CAL的相關(guān)性更大。

表2 牙周臨床指標(biāo)與GCF中生物標(biāo)志物水平的相關(guān)性Table 2 Correlation between periodontal parameters and the levels of biomarkers in GCF

2.4 GCF中生物標(biāo)志物水平與該位點牙周炎進展間的關(guān)系

在牙周基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個月的隨訪期間，≥90%的牙周炎位點沒有新的附著喪失，這些位點GCF中IL-6、TNF-α、IL-10和ALP水平相較上一次，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖1）。但是，有不超過10%位點出現(xiàn)了牙周炎進展，這些位點GCF中的IL-6、TNF-α、IL-10和ALP水平與上一次檢查相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.005）（表3）。

3 討論

目前臨床上常用牙周臨床指標(biāo)如附著喪失、探診深度、骨喪失、牙齒松動、牙齒移位、牙菌斑指數(shù)、牙齦退縮和影像學(xué)表現(xiàn)來反映牙周炎癥和牙周治療的效果。但是，這些指標(biāo)存在一定的滯后性，并且?guī)в幸欢ǖ闹饔^性。因此，尋找一種更準(zhǔn)確、更靈敏并且能夠客觀地評估牙周狀態(tài)、預(yù)測牙周組織破壞的方法是很有必要的。

GCF是一種血清滲出液，它包含血清的許多成分和局部產(chǎn)生的生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，GCF中數(shù)十種生物標(biāo)志物可用于評估牙周炎的發(fā)生和發(fā)展［9-10］，研究GCF用于牙周炎的診斷、治療評估以及疾病發(fā)展的監(jiān)測是當(dāng)前牙周病學(xué)的重要課題之一［11-12］。在炎癥狀態(tài)下，許多細(xì)胞因子、酶和蛋白質(zhì)，被釋放到GCF中［6，13］。在這些生物標(biāo)志物中，IL-6是與牙周組織破壞有關(guān)的促炎因子，被認(rèn)為與牙周疾病的進展有關(guān)［14-16］。研究者認(rèn)為，IL-6在激活炎癥介質(zhì)釋放的同時還可以促進炎癥細(xì)胞聚集［17］。同樣，TNF-α可以激活破骨細(xì)胞并促進骨吸收，與牙周病的發(fā)展密切相關(guān)［18］?？寡滓蜃覫L-10則可以抑制一系列促炎因子的產(chǎn)生，例如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶等［19］，同時IL-10也參與調(diào)節(jié)了骨吸收過程［20］。ALP是骨代謝、炎癥反應(yīng)和牙周再生中一種重要的酶，白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等許多細(xì)胞均可產(chǎn)生堿性磷酸酶［21］。

表3 牙周基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個月，出現(xiàn)牙周炎進展的位點GCF中生物標(biāo)志物水平Table 3 Levels of biomarkersin GCFat the sitesof periodontitis progression 1,3,6,and 12 months after nonsurgical periodontal therapyx±s

目前已經(jīng)有研究通過檢測牙周炎患者GCF中的成分來評估牙周組織的炎癥狀況或牙周治療的效果［22-24］。還有研究通過測量GCF中炎性介質(zhì)水平來評估個人患牙周疾病的風(fēng)險［9，25］。然而，本研究采樣方法較其他研究有一定先進性，即采樣前不探診，根據(jù)齦緣位置和影像學(xué)檢查顯示的牙槽骨位置預(yù)估PD，以避免探診后采樣導(dǎo)致牙周袋內(nèi)GCF被干擾，從而獲得相對真實的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，重度慢性牙周炎患者的炎癥位點IL-6、TNF-α和ALP水平顯著高于志愿者的牙周健康位點，對照組牙周健康位點的IL-10水平高于牙周炎患者炎癥位點的IL-10水平，說明不同牙周狀態(tài)下GCF中以上4種生物標(biāo)志物水平不同，這與以前研究結(jié)果的趨勢基本一致［16，18，26-27］，說明本研究選取的這4種生物標(biāo)志物有一定的代表性。

此外，本研究結(jié)果顯示，同一患者不同位點GCF中4種生物標(biāo)志物水平亦不同，在患者深袋位點GCF中IL-6、TNF-α和ALP水平的水平顯著高于淺袋位點的水平，深袋位點GCF中IL-10水平顯著低于淺袋位點水平，進一步證明了IL-6、IL-10、TNFα和ALP能反映該位點的牙周狀態(tài)。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)臨床指標(biāo)（PD、CAL、PLI和SBI）與IL-6、IL-10、TNF-α、ALP水平之間存在顯著相關(guān)性，這些結(jié)果說明GCF中生物標(biāo)志物的水平與牙周組織破壞的程度相關(guān)。其中，GCF中4種生物標(biāo)志物水平與PD、CAL的相關(guān)性更大。

有研究表明，在菌斑控制良好的基礎(chǔ)上，在一些深牙周袋也可以通過牙周基礎(chǔ)治療達到良好的治療效果，無需進一步的手術(shù)治療［28-30］。迄今為止，許多研究報道了基礎(chǔ)治療后GCF中生物標(biāo)志物的變化［31-33］。本研究中，基礎(chǔ)治療后，重度慢性牙周炎患者淺袋、深袋位點GCF中的TNF-α和ALP水平顯著降低，IL-10水平顯著升高，但是只有深袋位點GCF中的IL-6水平顯著降低，淺袋位點的IL-6水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明IL-6的敏感程度可能不如其他3種生物標(biāo)志物。此外，這4種生物標(biāo)志物水平在深袋位點的變化比淺袋位點更顯著。通過檢測GCF中的TNF-α、IL-10、ALP，可評估牙周基礎(chǔ)治療效果。本研究結(jié)果與以往的研究結(jié)果的變化趨勢基本一致［34，19，32-35］，但具體數(shù)值并不相同，原因可能包括種族原因、個體差異、不同的樣本量和不同的測量方法，后續(xù)可能需要更多的樣本量，以提供更準(zhǔn)確的結(jié)果。

本研究結(jié)果顯示，在基礎(chǔ)治療后1、3、6、12個月的隨訪期間，90%以上位點GCF中的IL-6、TNFα、IL-10、ALP水平與上一次相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。兩次隨訪之間有部分位點的CAL增加≥2 mm，即這些位點出現(xiàn)了牙周炎進展，可能是由于清創(chuàng)不徹底和/或口腔衛(wèi)生不佳導(dǎo)致的，在這些位點的GCF中，TNF-α、ALP、IL-6水平顯著升高，IL-10水平顯著降低。這說明，GCF這4種生物標(biāo)志物可能是評估局部位點牙周炎進展的有價值的指標(biāo)。

綜上，本研究檢測重度慢性牙周炎患者不同位點中GCF中細(xì)胞因子和酶水平，以評估其水平與牙周狀態(tài)的關(guān)系，以及判斷牙周基礎(chǔ)治療的療效和牙周炎的預(yù)后，這是國內(nèi)首次對牙周基礎(chǔ)治療后隨訪期間發(fā)生了牙周炎進展的位點進行GCF中TNF-α、IL-10、IL-6炎癥因子和ALP的檢測，結(jié)果表明，GCF中這4種生物標(biāo)志物表達水平作為炎癥相關(guān)指標(biāo)可輔助判斷重度慢性牙周炎患者局部位點的牙周炎進展情況及牙周基礎(chǔ)治療的療效，將來可能作為預(yù)測牙周組織破壞程度的敏感指標(biāo)應(yīng)用于臨床。

【Author contributions】 Zhang Q collected the GCF samples，performed the research，analyzed the data and wrote the article.Chen B performed the periodontal treatment and revised the article.Yan FH designed the study and revised the article.All authors read and approved the final manuscript submitted.