王俊峰，關(guān)雪峰，楊永菊，張宇鵬，王 群

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110032）

滑膜炎是指滑膜組織受到急性創(chuàng)傷或慢性勞損等刺激引起的無(wú)菌性炎癥，在臨床中患者多表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動(dòng)障礙等癥狀［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)滑膜炎的發(fā)病率很高約為7. 6%［2］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于滑膜炎治療主要采取口服非甾體抗炎藥及關(guān)節(jié)腔穿刺抽液治療，雖短時(shí)療效較好，但病因未除，仍會(huì)反復(fù)發(fā)作遷延不愈，嚴(yán)重影響患者日常生活［3］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中認(rèn)為滑膜炎的發(fā)病是由于本體氣血虧虛，復(fù)感風(fēng)寒濕之邪，致使邪氣入里化熱，流注于關(guān)節(jié)而引發(fā)的，其中濕熱內(nèi)蘊(yùn)是本病發(fā)病的根本，治法應(yīng)以清熱利濕為主［4］。

四妙散首載于清代張秉成的《成方便讀》，具有清熱利濕，舒筋壯骨的功效，方由蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁四味藥物組成，蒼術(shù)寒涼苦燥以除濕邪之來(lái)源；黃柏辛苦而溫走下焦以除肝腎之濕熱；薏苡仁入陽(yáng)明胃經(jīng)祛濕熱而利筋骨；牛膝補(bǔ)肝腎兼領(lǐng)諸藥之力以直入下焦，四藥合用對(duì)于濕熱下注的疾病治療效果顯著［5］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)蒼術(shù)的主要活性成分為倍半萜類、烯炔類、三萜及甾體類等化合物，具有抗炎、抗病毒等作用，尤以對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效顯著［6］；黃柏的主要化學(xué)成分為生物堿、黃酮類、甾醇類化合物，可以抗氧化、抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)［7］；而牛膝主要為甾酮類、皂苷類和多糖類化合物，具有促進(jìn)軟骨修復(fù)，抗脂質(zhì)過(guò)氧化等作用［8］；薏苡仁主要活性成分包括酯類、不飽和脂肪酸類、糖類及內(nèi)酰胺類等，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、增強(qiáng)免疫的作用［9］。近來(lái)有研究表明四妙散可以通過(guò)抑制家兔血清中IL-1β 和TNF-α 的表達(dá)，達(dá)到治療創(chuàng)傷性滑膜炎的作用［10］。在探究四妙散對(duì)滑膜炎的治療效果中，劉晗等［11］研究發(fā)現(xiàn)四妙散不僅可以明顯降低滑膜炎患者外周血中炎性因子的表達(dá)水平，還可以降低致痛介質(zhì)前列腺素及NO、5-羥色胺的表達(dá)水平，證實(shí)了四妙散具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛效果。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于大數(shù)據(jù)時(shí)代背景下的新興研究方法，基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，通過(guò)利用多種網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)和計(jì)算機(jī)軟件，構(gòu)建“中藥-基因-疾病”的關(guān)系網(wǎng)，為中藥復(fù)方潛在活性成分與作用靶點(diǎn)的研究提供指導(dǎo)［12］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究四妙散對(duì)于滑膜炎治療的潛在作用機(jī)制，以期對(duì)四妙散的臨床應(yīng)用及滑膜炎疾病的臨床研究提供相應(yīng)的參考。

1 材料與方法

1.1 關(guān)鍵活性成分收集

以“蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁”為關(guān)鍵詞在TCMSP 系統(tǒng)（http：//Lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中查找以上四味藥物的組成成分及藥物所含化學(xué)成分信息。按照口服生物利用度（OB）和藥物相似度（DL）篩選牛膝關(guān)鍵活性成分?？诜锢枚仁侵钢苿┲兴幬锉晃者M(jìn)入人體循環(huán)的速度和成度，藥物相似度是指化合物與已知藥物的相似性，這兩者對(duì)于判斷藥物的活性成分具有重要意義，本研究根據(jù)以往研究，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 作為篩選藥物關(guān)鍵活性化合物的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 構(gòu)建四妙散化學(xué)成分-靶點(diǎn)基因-滑膜炎疾病的網(wǎng)絡(luò)

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查找蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁化學(xué)成分的蛋白作用靶點(diǎn)，采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）查 詢 蛋 白 所 對(duì) 應(yīng) 的 基因，進(jìn)行歸納總結(jié)，得到四妙散關(guān)鍵活性化合物基因。同 時(shí) 借 助Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）和DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）等數(shù)據(jù)庫(kù)，以“synovitis”為關(guān)鍵詞檢索出與滑膜炎疾病相關(guān)的基因。并將得到的四妙散關(guān)鍵活性化合物基因和滑膜炎疾病基因結(jié)果輸入在線韋恩圖平臺(tái)（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）獲得交集基因和韋恩圖，并利用Cytoscape 軟件構(gòu)建可視化圖片。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

PPI 網(wǎng)絡(luò)為蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，其可以反映蛋白之間相互作用關(guān)系。將四妙散與滑膜炎疾病共同作用靶點(diǎn)基因?qū)雜tring 軟件中（https：//string-db.org/），物種選擇Homo sapiens，隱藏游離蛋白，并下載PPI 蛋白互作關(guān)系圖，篩選前30 個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因，繪制柱狀圖。

1.4 相關(guān)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用R 語(yǔ)言的Bioconductor 生物學(xué)數(shù)據(jù)包進(jìn)行基因GO 功能和KEGG 通路富集分析，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，設(shè)置P值為0.05，Q值為0.05 進(jìn)行GO 生物學(xué)富集分析和KEGG 通路富集分析，輸出結(jié)果并繪制barplot 柱狀圖和氣泡圖，最后分析結(jié)果討論四妙散對(duì)于滑膜炎的治療機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 活性化合物的篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)按照OB≥30%，DL≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到四妙散的活性化合物75個(gè)，其中蒼術(shù)9 個(gè)，黃柏37 個(gè)，牛膝20 個(gè)，薏苡仁20個(gè)，剔除重復(fù)化合物共得到64 個(gè)關(guān)鍵活性化合物，包括巴馬汀、原藜蘆堿、四氫小檗堿等成分。選取前20 個(gè)活性化合物，按照OB 值的由大到小排序，見(jiàn)表1。

表1 四妙散前20 個(gè)關(guān)鍵活性化合物成分Tab 1 Top 20 key active compounds of Simiao powder

2.2 四妙散活性化合物靶點(diǎn)與滑膜炎疾病靶點(diǎn)交集基因

通 過(guò)Genecards、OMIM 和DisGeNET 等 數(shù) 據(jù)庫(kù)搜索與滑膜炎相關(guān)的靶點(diǎn)基因共884 個(gè)，將四妙散與滑膜炎的靶點(diǎn)基因?qū)隕xcel 中獲得四妙散-滑膜炎的共同靶點(diǎn)，利用在線韋恩圖平臺(tái)繪制韋恩圖，記錄共同靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的滑膜炎關(guān)鍵化合物，剔除無(wú)關(guān)化合物。最終得到與四妙散-滑膜炎相關(guān)的關(guān)鍵化學(xué)成分37 種，四妙散-滑膜炎的共同靶點(diǎn)71個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 四妙散-滑膜炎交集基因韋恩圖Fig 1 Venny diagram of Simiaosan-synovitis intersection genes

2.3 藥物-疾病靶點(diǎn)可視網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將2.2 中獲得的交集基因和37 種關(guān)鍵化合物導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，構(gòu)建藥物-疾病可視化網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共110 個(gè)節(jié)點(diǎn)（71 個(gè)基因，37 個(gè)關(guān)鍵化合物，1個(gè)疾病名稱，1 個(gè)藥物名稱），其中紫色三角表明37種關(guān)鍵化合物成分，活性化合物包括甾體類、黃酮類等化學(xué)種類。藍(lán)色菱形代表71 個(gè)交集基因。在上述網(wǎng)絡(luò)中，每一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值表示藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中的節(jié)點(diǎn)之間相連的路線的條數(shù)。節(jié)點(diǎn)的度數(shù)越大代表其越有可能成為網(wǎng)絡(luò)中的中樞節(jié)點(diǎn)。從化學(xué)成分來(lái)看，度數(shù)排名在前四的為：槲皮素（quercetin）56）、山 奈 酚（kaempferol）（23）、漢 黃 芩 素（wogonin）（21）、黃芩素（baicalein）（15）。從靶點(diǎn)的角 度，度 數(shù) 前 四 的 分 別 為PTGS2、PTGS1、AR、PGR，其分別可以與28、21、16、15 個(gè)化合物發(fā)生作用。在根據(jù)以上的網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析中，可以發(fā)現(xiàn)四妙散的關(guān)鍵的化合物可以對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)具有調(diào)控作用，這種調(diào)控作用體現(xiàn)了藥物靶點(diǎn)的多樣性及生物網(wǎng)絡(luò)的協(xié)同性。見(jiàn)圖2 及表2。

表2 四妙散治療滑膜炎交集基因Tab 2 Intersection genes of Simiao powder in treatment of synovitis

圖2 四妙散-滑膜炎可視化網(wǎng)絡(luò)Fig 2 Simiaosan-synovitis visualization network

2.4 蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)（PPICN）的構(gòu)建與篩選

將2.2 中獲得71 個(gè)交集基因輸入string 軟件中得到圖3，其中節(jié)點(diǎn)代表相關(guān)蛋白，每條邊代表蛋白與蛋白相互作用關(guān)系，邊數(shù)越多的蛋白表明其是核心蛋白的可能性越大，選取排名靠前的30 個(gè)蛋白構(gòu)建柱狀圖如圖4，前30 個(gè)蛋白名稱分別為：JUN、AKT1、MAPK1、RELA、FOS、IL6、MAPK14、ESR1、VEGFA、EGFR、CXCL8、IL1B、MAPK8、MYC、STAT1、CASP8、CCND1、PRKCA、BCL2、BCL2L1、CASP3、CCL2、EGF、IL2、IFNG、NFKBIA、CXCL2、FN1、IL10、NOS3。這些蛋白對(duì)于滑膜炎的治療起著關(guān)鍵的作用。

圖3 四妙散-滑膜炎蛋白相互作用核心網(wǎng)絡(luò)Fig 3 Core network of interaction between Simiaosan-synovitis proteins

圖4 核心蛋白柱狀圖Fig 4 Core protein histogram

2.5 生物學(xué)（GO）富集分析結(jié)果

GO 富集分析結(jié)果共得到90 條GO 生物學(xué)富集過(guò)程，按照富集基因數(shù)目排名，排名靠前的主要為：細(xì)胞因子受體結(jié)合（CASP3/CCL2/CD40LG/CXCL10/CXCL11/CXCL2/CXCL8/IFNG/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/STAT1/TNF/VEG -FA），受 體 配 體 活 性（CCL2/CD40LG/CXCL10/CXCL11/CXCL2/CXCL8/EGF/IFNG/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/SPP1/TNF/VEGFA），細(xì)胞因子活性（CCL2/CD40LG/CXCL10/CXCL11/CXCL2/CXCL8/IFNG/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/SPP1/TNF/VEGFA），DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性（AR/ESR1/FOS/HIF1A/JUN/MYC/NFATC1/NR1I2/NR3C1/PGR/STAT1/TP53） ，生長(zhǎng)因子受體結(jié)合（EGF/IL10/IL1A/IL1B/IL2/IL4/IL6/VEGFA），前20 位GO 生物學(xué)過(guò)程富集分析，見(jiàn)圖5。通過(guò)GO 生物學(xué)富集可以看出四妙散通過(guò)多種生物學(xué)調(diào)控達(dá)到治療滑膜炎的效果。

圖5 四妙散活性成分治療滑膜炎關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO 生物學(xué)過(guò)程富集分析barplot 柱狀圖Fig 5 Barplot histogram of GO biological process enrichment analysis of key targets of Simiao powder in treatment of synovitis

2.6 靶點(diǎn)通路分析（KEGG）

通過(guò)KEGG 得到四妙散治療滑膜炎關(guān)鍵靶點(diǎn)基因主要富集在142 條通路（P＜0.05），提取前20個(gè)信號(hào)通路繪制barplot 柱狀圖和氣泡圖，見(jiàn)圖6、7。在142 條信號(hào)通路中與滑膜炎關(guān)系密切的有32 條信號(hào)通路，根據(jù)P值由小到大的排序繪制表3，表中涉及IL-17 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)、Toll 樣受體信號(hào)通路等多種信號(hào)通路。這表明四妙散治療滑膜炎涉及不同信號(hào)通路的調(diào)控，且信號(hào)通路相互關(guān)聯(lián)，這體現(xiàn)了信號(hào)通路的協(xié)同發(fā)揮作用。

圖6 四妙散治療滑膜炎關(guān)鍵靶點(diǎn)富集信號(hào)通路barplot 柱狀圖Fig 6 Barplot histogram of signal pathway of key target enrichment of Simiao powder in treatment of synovitis

圖7 四妙散治療滑膜炎關(guān)鍵靶點(diǎn)富集信號(hào)通路氣泡圖Fig 7 Bubble chart of signal pathway enriched by key target of Simiao powder in treatment of synovitis

表3 四妙散與滑膜炎相關(guān)信號(hào)通路Tab 3 Signal pathways of Simiao powder and synovitis

3 討論

滑膜炎在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中歸屬于“骨痹”“筋傷”等范疇。《素問(wèn)·生氣通天論》中指出：“濕熱不攘，大筋軟短，小筋弛長(zhǎng)，軟短為拘，弛長(zhǎng)為痿”?！端貑?wèn)·至真要大論》中也提到：“諸脹腫大，皆屬于熱；……諸病胕腫，疼酸驚駭，皆屬于火?！保?3，14］。本病病機(jī)在于濕熱閉阻，治法以清熱利濕，舒筋通絡(luò)為主，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為滑膜組織中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及滑膜細(xì)胞過(guò)度增殖是滑膜炎的主要病理特征，滑膜炎的發(fā)病也常常與骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)等疾病關(guān)系密切［15］。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討四妙散對(duì)于滑膜炎治療的潛在作用機(jī)制，通過(guò)檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)得到四妙散關(guān)鍵化學(xué)成分64 個(gè)，參與調(diào)節(jié)四妙散-滑膜炎相關(guān)的關(guān)鍵化學(xué)成分37 個(gè)，且度數(shù)在前四位的槲皮素、山奈酚、漢黃芩素和黃芩素均為黃酮類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有具有良好的抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛作用，可以對(duì)骨關(guān)節(jié)損傷類疾病具有良好的治療效果［16］。從靶點(diǎn)角度來(lái)看，排名靠前的為PTGS2（COX-2）和PTGS1（COX-1），二者均為前列腺素生成的主要限速酶。王鳳龍等［17］研究證實(shí)滑膜炎患者滑膜細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中存在前列腺素過(guò)度表達(dá)情況，且通過(guò)藥物抑制前列腺素的表達(dá)，可以明顯改善滑膜細(xì)胞的炎性狀態(tài)［18］。AR 為雄激素受體，在網(wǎng)絡(luò)中共與16 個(gè)活性成分有關(guān)，現(xiàn)代研究表明，在炎癥期間低水平的雄激素會(huì)促使芳香化酶合成，芳香化酶會(huì)誘導(dǎo)雄激素轉(zhuǎn)換成雌激素，進(jìn)而激活滑膜成纖維細(xì)胞，加重滑膜增生［19］。PGR 為孕激素受體，至少與15 個(gè)活性成分相關(guān)，以上四者均為四妙散的靶標(biāo)核心。通過(guò)可視化網(wǎng)絡(luò)可見(jiàn)四妙散是通過(guò)多途徑多靶點(diǎn)發(fā)揮作用，并具有多種潛在作用機(jī)制。

PPI 是表明蛋白與蛋白相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)，研究得到PPI 網(wǎng)絡(luò)中與炎性反應(yīng)蛋白居多，其中JUN、MAPK1、AKT1、IL6、MAPK14 等均與滑膜細(xì)胞的炎性反應(yīng)有關(guān)，據(jù)此推測(cè)四妙散主要通過(guò)改善滑膜細(xì)胞的炎性狀態(tài)，達(dá)到治療滑膜炎疾病的作用。此外PPI 網(wǎng)絡(luò)也尚與細(xì)胞凋亡、微循環(huán)等有著密切的聯(lián)系，這也為探究藥物的作用機(jī)制提供了相應(yīng)的參考。

GO 生物學(xué)富集過(guò)程提示滑膜炎的治療與細(xì)胞因子受體結(jié)合和細(xì)胞因子活性密切相關(guān)，且主要抑制炎性基因酶活性，完成細(xì)胞修復(fù)與再生，這與PPI得到的結(jié)果相吻合。通過(guò)KEGG 信號(hào)通路富集分析，得到32 條與滑膜炎治療相關(guān)的信號(hào)通路，其中包括炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、微循環(huán)等多方面。（1）炎性反應(yīng)：富集數(shù)目最多的為IL-17 信號(hào)通路，Th17細(xì)胞主要分泌IL-17，IL-17 是一種促炎細(xì)胞因子，主要通過(guò)誘導(dǎo)破骨細(xì)胞和基質(zhì)金屬蛋白酶生成，加重關(guān)節(jié)滑膜炎癥及關(guān)節(jié)畸形［20］。TNF 是一種炎性反應(yīng)介質(zhì)，不僅可以誘導(dǎo)前列腺素膠原酶的分泌和滑膜細(xì)胞合成加重炎性反應(yīng)過(guò)程，還可以與TNFR1受 體 結(jié) 合，激 活NF-κB 與p38 信 號(hào) 通 路［21，22］。在 炎性反應(yīng)中，Toll 樣受體信號(hào)通路可與NF-κB 信號(hào)通路發(fā)生協(xié)同作用，兩者可以共同促使滑膜細(xì)胞異常增生［23］。MAPK 信號(hào)通路是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶系統(tǒng)，當(dāng)受到外界刺激后，會(huì)激活MAPK 信號(hào)通路釋放轉(zhuǎn)錄活化因子，引起MAPK 逐級(jí)磷酸化，促使ERK 參與細(xì)胞的增值與分化，p38 參與炎性反應(yīng)的表達(dá)［24-35］。Wnt 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化的重要通路之一，實(shí)驗(yàn)性阻斷Wnt 信號(hào)通路，可以有效降低滑膜細(xì)胞中白細(xì)胞介素和RANKL 的表達(dá)，也有相關(guān)研究表明Wnt 信號(hào)通路可以對(duì)破骨細(xì)胞的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用［26］。（2）抗氧化損傷：FoxO信號(hào)通路可以調(diào)控細(xì)胞的增殖和氧化應(yīng)激反應(yīng)。FoxO 具有4 個(gè)同源基因，其中與滑膜細(xì)胞關(guān)系最為密切的是FoxO3a，俞晨等［27］研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)藥物促進(jìn)FoxO3a 的表達(dá)，可以有效提高成纖維滑膜細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。（3）細(xì)胞凋亡：主要與JAK-STAT 信號(hào)通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)炎性介質(zhì)IL-6 可以激活該信號(hào)通路，誘導(dǎo)STAT3 磷酸化，促使相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，增加滑膜細(xì)胞抗性［28］。（4）微循環(huán)：在微循環(huán)中，PI3K-Akt、VEGF 與HIF-1 可 以 表 現(xiàn) 出 協(xié) 同 作 用，PI3K-Akt 通路激活可以促使組織細(xì)胞炎性反應(yīng)增強(qiáng)，促使其下游底物mTOR 合成，mTOR 可以作為樞紐，調(diào)節(jié)下游目的基因VEGF、HIF-1 共同參與調(diào)控滑膜中新生血管生成［29］。Apelin 信號(hào)通路、脂肪因子及促炎因子等都可以加重骨性關(guān)節(jié)炎，而骨性關(guān)節(jié)炎是導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎的另一誘因［30］。KEGG 信號(hào)通路富集中結(jié)果顯示滑膜炎疾病治療與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切，這與目前已知的研究是相吻合的。

綜上所述，四妙散主要通過(guò)影響炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、微循環(huán)等途徑干預(yù)滑膜炎。研究通過(guò)構(gòu)建“中藥-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)對(duì)四妙散的關(guān)鍵活性成分以及靶標(biāo)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并將研究結(jié)果與已知實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，所得結(jié)果真實(shí)可靠，為后續(xù)的四妙散的臨床應(yīng)用及滑膜炎相關(guān)疾病基礎(chǔ)與臨床研究提供了數(shù)據(jù)支持。