屈 姣 張 毅 （鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心，鄭州450052）

肺癌是全球發(fā)病率及死亡率最高的腫瘤之一［1-2］。因缺乏有效診斷標(biāo)志物，肺癌早期診斷率低，發(fā)現(xiàn)時多數(shù)已處于晚期，導(dǎo)致其治療效果差，預(yù)后不良，死亡率較高［3］。根據(jù)組織學(xué)特點(diǎn)可將肺癌分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，85%約為非小細(xì)胞肺癌，其中肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是非小細(xì)胞肺癌的主要組織學(xué)類型［4］。由于多數(shù)肺癌發(fā)現(xiàn)時即晚期，急需從蛋白、分子等水平深入探究肺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，為肺癌患者的早期診斷及預(yù)后評估尋找高敏感指標(biāo)，進(jìn)一步為肺癌防治提供新策略。

目前非小細(xì)胞肺癌的治療方式主要包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療等，但5 年生存率較低。近年腫瘤免疫治療已廣泛應(yīng)用于腫瘤治療領(lǐng)域，但如何尋找更加精準(zhǔn)有效的生物標(biāo)志物篩選腫瘤免疫治療的獲益人群是急需突破的瓶頸［5-7］。

GRAP2（Gads/Mona/GrpL/Grf40）是白細(xì)胞激活信號通路上重要的一類銜接蛋白［8］。GRAP2 在T細(xì)胞中的功能備受關(guān)注，為活化銜接因子（linker for activation of T cells，LAT）和含 76 kD SH2 結(jié)構(gòu)域的白細(xì)胞蛋白（SH2-domain-containing leukocyte pro?tein of 76 kD，SLP-76）提供了物理和功能連接［9］。連接 T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）后，GRAP2 的SH2 結(jié)構(gòu)域與酪氨酸磷酸化的LAT 結(jié)合，其羧基端SH3 結(jié)構(gòu)域組成性結(jié)合 SLP-76。LAT、GRAP2 和SLP-76 形成異源三聚體復(fù)合物介導(dǎo)TCR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而將膜近端信號與下游信號通路耦合，對T 細(xì)胞中鈣離子信號調(diào)節(jié)具有重要作用，對介導(dǎo)T 細(xì)胞活化起重要作用［10-11］。

TCGA 數(shù)據(jù)庫已廣泛應(yīng)用于癌癥發(fā)生發(fā)展機(jī)制探究，包括肺癌研究［12］。本研究采用TCGA 數(shù)據(jù)庫分析GRAP2 基因在LUAD 中的表達(dá)及其臨床意義，并采用GEO 數(shù)據(jù)庫及臨床組織標(biāo)本驗(yàn)證確定GRAP2 可作為LUAD 早期診斷并預(yù)測患者預(yù)后的潛在臨床指標(biāo)，同時為篩選免疫治療潛在獲益人群提供新思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 數(shù)據(jù)資料收集 采用UCSC Xena 數(shù)據(jù)庫（http：/ /xena. ucsc. edu/）下 載 TCGA 數(shù) 據(jù) 庫 中LUAD 組織RNA 表達(dá)數(shù)據(jù)及其相應(yīng)的患者臨床信息。納入標(biāo)準(zhǔn)為具有完整的RNA 表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床參數(shù)信息。臨床信息包括生存期、年齡、性別、T 期、N 期、M 期和腫瘤分期。通過在線分析GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：/ /gepia. cancer-pku. cn/）合并TCGA 數(shù)據(jù)集和GTEx 數(shù)據(jù)集增加正常肺組織組標(biāo)本數(shù)進(jìn)一步比較LUAD 組織與正常組織GRAP2 表達(dá)。GEO 數(shù)據(jù)庫（https：/ /www. ncbi. nlm. nih. gov/gds/）獲得LUAD 表達(dá)譜芯片（GSE75037），包括 83 個LUAD 組織和83 個癌旁正常組織。采用TIMER 數(shù)據(jù)庫（https：/ /cistrome. shinyapps. io/timer/）分析GRAP2表達(dá)與免疫浸潤細(xì)胞相關(guān)性，包括B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。單樣本基因集富集分析（single sample GSEA，ssGSEA）采用R 軟件“GSVA”包對LUAD FP?KM 數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到各樣品中28 種免疫細(xì)胞類型評分。

1.1.2 臨床組織標(biāo)本收集 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院標(biāo)本庫中2014 年1 月至2015 年12 月于我院手術(shù)切除的53 例LUAD 組織樣本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理學(xué)確認(rèn)為LUAD；②手術(shù)前未經(jīng)系統(tǒng)放化療治療；③臨床參數(shù)信息完整，包括：性別、年齡及分期等，并有完備的隨訪信息以便統(tǒng)計(jì)患者生存期。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)（編號：2019-KY-256），參與者知情同意。

1.1.3 主要試劑 Trizol 試劑（Invitroge 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑（TaKaRa 公司）；SYBR Green（Bioconnect Services公司）。

1.2 方法

1.2.1 組織RNA 提取 根據(jù)LUAD 納入標(biāo)準(zhǔn)篩選入組標(biāo)本，取我院凍存于?80℃標(biāo)本庫的LUAD 標(biāo)本，解凍，剪成50~100 mg 組織塊，置于2 ml 無酶管中，每管加入適量Trizol 試劑和無酶鋼珠，研磨，高速離心，取上層勻漿置于新的離心管，加入500μl氯仿，蓋緊離心管蓋上下顛倒混勻10 次，充分混合乳化，冰上靜置5 min，4℃、12 000 r/min 離心15 min，取上層無色透明水相轉(zhuǎn)移至新的無酶離心管中，加入 500 μl 異丙醇，顛倒混勻，冰上靜置 5~10 min，4℃、12 000 r/min 離心10 min，棄上清，緩慢加入預(yù)冷75%乙醇（無酶水與無水乙醇按相應(yīng)比例配制），4℃、12 000 r/min 離心5 min，清洗，棄上清，將離心管倒置，控干殘留乙醇，加入適量無酶水溶解RNA，采用Nanodrop儀檢測RNA純度及濃度。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄全程冰上操作。配制基因組DNA 去除反應(yīng)體系：5×gDNA Eraser Buffer 2 μl，gDNA 1 μl，RNA 1 μg，無酶水補(bǔ)齊體系至10 μl，混勻，42℃反應(yīng)2 min。配制反轉(zhuǎn)錄體系：PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl，PrimeScrip buffer（5×）4 μl，RT Prime Mix 1 μl，無酶水4 μl，共計(jì)10 μl，加至基因組DNA 去除反應(yīng)后的體系，采用普通PCR 儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：37℃15 min，85℃5 s，反應(yīng)結(jié)束后得到組織標(biāo)本cDNA。

1.2.3 qRT-PCR 檢測 SYBR Green 10 μl，上游引物（10 μmol/L）0.8μl，下游引物（10μmol/L）0.8 μl，cDNA 2 μl，無酶水 6.4 μl。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。采用Agi?lent Mx3005P 儀進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，95℃ 60 s；95℃ 15 s；60℃ 15 s；72℃ 45 s，帶溶解曲線，重復(fù) 39 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 水平。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，均數(shù)比較分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和配對樣本t檢驗(yàn)。MedCal 軟件分析并繪制 ROC 曲線，Prism 8 軟件分析并繪制 Kaplan-Meier plotter 圖，log.rank 檢驗(yàn)分析GRAP2 表達(dá)與生存期的關(guān)系。Pearson 相關(guān)分析評估基因表達(dá)相關(guān)性。采用Cox 多因素回歸，以“輸入”法分析GRAP2 表達(dá)及臨床參數(shù)對生存期的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中LUAD 組織 GRAP2 表達(dá)及生存分析 TCGA 數(shù)據(jù)庫顯示，LUAD 組織中GRAP2表達(dá)水平低于正常組織（圖1A）。采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫整合TCGA 和GTEX 數(shù)據(jù)庫增加正常組織標(biāo)本數(shù)，對483例LUAD 樣本及347例正常組織樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，GRAP2 在LUAD 組織中呈低表達(dá)（圖1B）。ROC 曲線結(jié)果顯示，GRAP2 可作為LUAD診斷的潛在臨床指標(biāo)（圖1C）。生存分析結(jié)果顯示，GRAP2 低表達(dá)的LUAD 患者生存期較短，提示GRAP2可能是評估LUAD預(yù)后的潛在標(biāo)志物（圖1D）。

圖1 LUAD組織中GRAP2表達(dá)及生存分析Fig.1 Expression of GRAP2 and survival analysis in LUAD tissues

2.2 LUAD 中GRAP2 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 采用TCGA 數(shù)據(jù)庫中LUAD 患者臨床數(shù)據(jù)分析GRAP2與不同臨床病理特征間的關(guān)系，結(jié)果如圖2、表 2 顯示，腫瘤浸潤 T3~T4 期 GRAP2 mRNA 表達(dá)低于T1~T2 期（P=0.03），發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移期GRAP2mRNA表達(dá)低于無轉(zhuǎn)移期（P=0.01），病理分期Ⅲ~Ⅳ期GRAP2 mRNA表達(dá)低于Ⅰ~Ⅱ期患者（P=0.000 6）。ROC曲線表明，GRAP2分別作為診斷LUAD腫瘤浸潤（AUC=0.589，P=0.021 9）、淋 巴 結(jié) 轉(zhuǎn) 移（AUC=0.579，P=0.004 0）和臨床病理分期（AUC=0.622，P<0.000 1）具有優(yōu)越性。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤T3~T4 期預(yù)后差于T1~T2 期（P<0.000 1），發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)后差于無轉(zhuǎn)移患者（P<0.000 1），病理分期Ⅲ~Ⅳ期預(yù)后差于Ⅰ~Ⅱ期患者（P<0.000 1）。多因素Cox回歸分析年齡、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、病理分期和GRAP2 表達(dá)水平對LUAD 預(yù)后的影響，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.000 1）、GRAP2表達(dá)水平（P=0.017 0）對LUAD預(yù)后有明顯影響。

圖2 GRAP2表達(dá)與LUAD患者臨床病理特征的關(guān)系Fig.2 Relationship between GRAP2 expression and clini?copathological characteristics of patients with LUAD

表2 GRAP2 表達(dá)、各臨床參數(shù)與OS的多因素Cox回歸分析Tab.2 Cox regression analysis between GRAP2 expression，various clinical parameters and OS

2.3 GRAP2 與免疫細(xì)胞相關(guān)性分析 TIMER 數(shù)據(jù)庫分析GRAP2基因與免疫浸潤細(xì)胞的相關(guān)性，結(jié)果如圖 3所示，GRAP2與 B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的功能性分子相關(guān)基因GZMB、PRF1 呈正相關(guān)。采用ssGSEA 處理LUAD 的FPKM 數(shù)據(jù)，如表3所示，得到各樣品中28 種免疫細(xì)胞類型評分，將其與得到的免疫細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了GRAP2 與包括CD8+T 細(xì)胞在內(nèi)的各類免疫細(xì)胞呈正相關(guān)。

表3 GRAP2 表達(dá)與28 種免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析（ssG?SEA）Tab.3 Relationship analysis between GRAP2 expression and 28 immune cells（ssGSEA）

圖3 TIMER 數(shù)據(jù)庫分析GRAP2 與免疫細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞功能性分子相關(guān)性Fig.3 Relationship between GRAP2 and immune cells，functional related genes of CD8+T cells by TIMER database

2.4 GEO 數(shù) 據(jù)庫 GSE75037 驗(yàn) 證 GRAP2 在 LUAD中呈低表達(dá) 通過GEO 數(shù)據(jù)庫（https：/ /www.ncbi.nlm. nih. gov/gds/） 獲 取 LUAD 表 達(dá) 譜 芯 片（GSE75037），包括 83 個 LUAD 組織和 83 個癌旁正常組織，與癌旁正常組織相比，GRAP2 在LUAD 組織呈低表達(dá)（圖4）。

圖4 GRAP2在GEO數(shù)據(jù)集GSE75037中的表達(dá)Fig.4 Expression of GRAP2 in GEO database GSE75037

2.5 GRAP2 在LUAD 臨床組織標(biāo)本中的表達(dá)及其與CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性 收集我院接受手術(shù)切除治療的53例LUAD組織樣本，qRT-PCR檢測GRAP2在LUAD 組織及其相應(yīng)正常組織中的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證 LUAD 組織中 GRAP2 與 CD8+T 細(xì)胞的相關(guān)性，結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，GRAP2 在LUAD 組織中呈低表達(dá)（圖5A）。LUAD 組織中GRAP2 高表達(dá)組較低表達(dá)組預(yù)后更好（圖5B），且GRAP2與CD8+T細(xì)胞（圖5C、D）及其功能相關(guān)分子GZMB、PFR1 呈正相關(guān)（圖5E、F）。

圖5 臨床組織標(biāo)本中GRAP2 表達(dá)及其與LUAD 患者預(yù)后、CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性Fig.5 Expression of GRAP2 and its relationship with prognosis and CD8+T cells of LUAD patients

3 討論

LUAD 因其早期發(fā)現(xiàn)困難、預(yù)后不良而成為臨床死亡率較高的腫瘤之一［3］。隨著高通量測序技術(shù)發(fā)展，關(guān)于可從基因水平上診斷早期癌癥、判斷預(yù)后的生物標(biāo)志物的報(bào)道越來越多，為LUAD 臨床治療提供了參考。GRAP2 作為銜接蛋白，通過連接TCR 信號通路上下游的LAT 和SLP-76 形成異源三聚體復(fù)合物，對 T 細(xì)胞活化起橋梁作用［10-12］。GRAP2 在95%急性T 淋巴細(xì)胞白血病中表達(dá)，可作為其診斷的生物標(biāo)志物［13］。但GRAP2 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的報(bào)道較少。本研究采用TCGA 數(shù)據(jù)庫確定GRAP2可作為LUAD 早期診斷及預(yù)測LUAD 患者預(yù)后的潛在臨床指標(biāo)，同時為篩選免疫治療潛在獲益人群提供新思路，對LUAD 的早期診斷、預(yù)后判斷和免疫治療具有重要意義。

本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，GRAP2 在LUAD 組織中的表達(dá)明顯低于正常組織，ROC 曲線顯示GRAP2 可作為診斷LUAD 的潛在臨床指標(biāo)，并通過GEO 數(shù)據(jù)集GSE75037 和臨床肺腺癌標(biāo)本對TCGA數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，分別將TCGA數(shù)據(jù)庫來源的LUAD 患者標(biāo)本和收集的我院臨床LUAD 患者標(biāo)本分為基因高表達(dá)及低表達(dá)組，Ka?plan-Meier生存分析表明，GRAP2表達(dá)影響LUAD患者OS，GRAP2表達(dá)越低，患者OS越短。進(jìn)一步采用TCGA 數(shù)據(jù)庫中LUAD 患者臨床病理資料，通過GRAP2 基因在不同臨床階段的表達(dá)及ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，GRAP2 表達(dá)水平對腫瘤大小、淋巴結(jié)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和病理分期均有影響，同時可作為診斷LUAD惡性程度的潛在指標(biāo)。多因素Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)，LUAD 患者中高表達(dá)GRAP2 mRNA 組死亡風(fēng)險(xiǎn)約為低表達(dá)組的0.6 倍，提示GRAP2 可作為LUAD 臨床預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。GRAP2 基因表達(dá)水平與多種免疫細(xì)胞浸潤水平相關(guān)［14-15］。本研究采用TIM?ER 數(shù)據(jù)庫分析得到 GRAP2 mRNA 與包括 CD8+T 細(xì)胞在內(nèi)的各類免疫細(xì)胞呈正相關(guān)，也與CD8+T 細(xì)胞的功能性分子相關(guān)基因GZMB、PRF1 呈顯著正相關(guān)。進(jìn)一步采用ssGSEA 分析得到GRAP2 mRNA 與包括CD8+T細(xì)胞在內(nèi)的各類免疫細(xì)胞呈正相關(guān)。基因水平上往往以 CD8A 與 CD8B 表示 CD8+T 細(xì)胞［15］。本研究同時采用qRT-PCR法在臨床LUAD標(biāo)本中檢測CD8A、CD8B、GZMB、PRF1 及GRAP2 5 種基因表達(dá)水平，并探討其相關(guān)性，結(jié)果顯示，GRAP2 與CD8+T 細(xì)胞（CD8A、CD8B）及其功能性分子GZMB、PRF1 呈顯著正相關(guān)，表明高表達(dá)GRAP2 基因的LUAD 組織中，其腫瘤免疫微環(huán)境中富集各種包括CD8+T 細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞，且CD8+T 細(xì)胞處于功能激活狀態(tài)可能提示此為“熱腫瘤”，為選擇腫瘤免疫治療人群提供參考［16-17］。

綜上所述，GRAP2 與LUAD 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫、GEO 數(shù)據(jù)庫、臨床標(biāo)本3個維度確定GRAP2可作為LUAD早期診斷并預(yù)測LUAD 患者預(yù)后的潛在臨床指標(biāo)，同時也為篩選免疫治療潛在獲益人群提供新思路。