趙錛活 苗 蓓 費素娟 （徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化病研究中心，徐州 221000）

胃癌是全球第五大最常見的惡性腫瘤，也是第四大最常見的癌癥死亡原因［1］。在亞洲，日本、韓國及我國是胃癌高發(fā)區(qū)，我國每年新發(fā)病例約40 萬例，占世界總發(fā)病例數(shù)的42%。目前，胃癌早期治療的主要手段是手術(shù)治療，但多數(shù)胃癌患者就診時已處于進展期，失去了最佳手術(shù)時機。由于進展期胃癌的早期臨床癥狀缺乏典型性且預(yù)后差，因此，探究細胞內(nèi)分子表達異常、細胞信號通路以及腫瘤微環(huán)境變化在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，對胃癌的早期診斷、預(yù)后評估及尋找治療靶點顯得尤為重要。

微小染色體維持蛋白（minichromosome mainte?nance proteins，MCMs）家族最初是在釀酒酵母基因篩選中發(fā)現(xiàn)的，是一種廣泛存在于高等真核生物中并且高度保守的蛋白質(zhì)，在DNA 復(fù)制起始、延伸、轉(zhuǎn)錄、染色體重構(gòu)和基因組穩(wěn)定中起重要作用，并且在多種人類癌前病變及癌癥中異常表達，成為惡性腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物［2］。目前發(fā)現(xiàn)的MCM家族成員共有10 個，包括 MCM1～10。除 MCM1 和 MCM10 外，MCM2-9 蛋白在結(jié)構(gòu)上均存在一個約200 多個氨基酸長度的核心區(qū)域，稱為 MCM 盒（MCM box）［3］。有學(xué)者認(rèn)為MCM1 和MCM10 不屬于MCM 蛋白家族［4-5］。MCM2～7 通常形成六聚體復(fù)合物發(fā)揮生物學(xué)功能，這是啟動DNA合成的起始步驟［6-8］。近年來有不少研究指出，MCM2、4、5、7在胃癌組織中的表達水平均較正常胃黏膜組織顯著升高，且與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)［9-14］。MCM8 是 MCM 蛋白家族的重要成員，是在研究攜帶乙型肝炎病毒的肝癌患者定向基因時發(fā)現(xiàn)的［15］。近年來研究發(fā)現(xiàn)MCM8在多種人類癌癥，包括乳腺癌、非小細胞肺癌、肝癌、成髓細胞瘤和多形膠質(zhì)母細胞瘤中過表達，表明MCM8 過表達在人類惡性腫瘤中具有廣泛的意義［16］。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于MCM8在胃癌中的表達及其意義的研究較少，因此本研究基于生物信息學(xué)分析該基因在胃癌及癌旁組織中表達差異，通過免疫組化染色進一步驗證其蛋白水平的差異表達，并進一步預(yù)測其對胃癌的診斷、治療及預(yù)后的價值。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析MCM8 在人類常見類型腫瘤中的表達概況 Oncomine 數(shù)據(jù)庫（https：/ /www.oncomine.org）是一個在線的、可公開訪問的癌癥微陣列數(shù)據(jù)庫，其已經(jīng)收集了715 個數(shù)據(jù)集的86 733 個樣本的基因表達數(shù)據(jù)，整合了GEO、TCGA和已發(fā)表文獻等來源的RNA 和DNA-seq 數(shù)據(jù)，旨在促進基于全基因組表達分析的潛在靶基因的識別［17-18］。數(shù)據(jù)分析時，搜索MCM8 基因，analysis type設(shè) 置 為“Cancer vs Normal analysis”，以 log Fold Change≥2.0，P值<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，Gene Rank設(shè)置為“Top 10%”，Data type 設(shè)置為“mRNA”，調(diào)取MCM8基因在人類常見類型腫瘤中的表達概況。

1.1.2 GEO、TCGA 數(shù)據(jù)庫分析 MCM8 在胃癌中的表達情況 在GEO 數(shù)據(jù)庫（https：/ /www.ncbi.nlm.nih. gov/geo/）中搜索“gastric cancer”關(guān)鍵詞，獲取GSE27342 數(shù)據(jù)集中160 例胃癌組織和癌旁組織的基因表達譜，通過GEO2R 在線分析并提取MCM8基因表達量（探針編號為3875195），使用Graphpad Prism 8.2 軟件進一步統(tǒng)計分析；利用ULCAN（http：/ /ualcan. path. uab. edu/）工具分析 TCGA 數(shù)據(jù)庫中收集的415 例胃癌腫瘤組織和34 例癌旁組織中MCM8基因的表達水平，并進一步分析其與Tu?mor grade、Tumor stage的關(guān)聯(lián)。

1.1.3 實驗試劑 MCM8 兔抗人單克隆抗體購自美國Thermofisher公司，超敏二步法免疫組化檢測試劑、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋有限公司。

1.2 方法

1.2.1 胃癌組織樣本收集 收集2018 年1 月至2019年12月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院普外科手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本30例，并收集對應(yīng)的癌旁組織（距離腫瘤邊緣>5 cm）作為對照。所有患者均為初診患者，術(shù)前未行放、化療及生物免疫治療，所有胃癌標(biāo)本均經(jīng)本院病理證實。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，倫理審查意見號為XYFY2020-KL170-01。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 按超敏二步法免疫組化檢測系統(tǒng)進行，DAB 顯色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，正置顯微鏡拍照。胞核內(nèi)有棕色顆粒者為陽性細胞，運用Image Pro Plus 6.0 軟件分別對30 例胃癌和癌旁組織中MCM8 陽性染色的積分光密度值（integrated optical density，IOD）進行分析，使用GraphPad Prism8.2統(tǒng)計作圖。

1.2.3 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析生存率 運用 Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫（http：/ /kmplot. com/analy?sis/）分析胃癌基因芯片數(shù)據(jù)，篩選MCM8基因，根據(jù)胃癌組織中MCM8 基因表達水平的中位數(shù)進行高、低表達MCM8 基因分組，采用自動選擇截斷值（auto select best cutoff）分析MCM8表達高低對胃癌患者的總體生存率（overall survival，OS）的影響，并分別對HER2陰性、陽性的胃癌患者進行總體生存率及進展后生存率（post progression survival，PPS）進行分析。

1.2.4 TISIDB 數(shù)據(jù)庫分析MCM8 基因表達與胃癌腫瘤免疫浸潤水平的相關(guān)性 TISIDB（http：/ /cis.hku.hk/TISIDB/index.php）是腫瘤與免疫系統(tǒng)交互的門戶網(wǎng)站，其集成了包括PubMed 文獻挖掘結(jié)果、高通量測序篩選結(jié)果、TCGA、Uniprot 數(shù)據(jù)庫的多種數(shù)據(jù)類型。分析數(shù)據(jù)時搜索MCM8 基因，選擇“l(fā)ym?phocyte”，cancer type 選 擇“stomach adenocarcino?ma”，item 分別選擇“Activated CD4+T cell”、“Activat?ed CD8+T cell”、“Activated B cell”、“Natural killer cell”、“dendritic cell”，以探討 MCM8 表達與胃癌腫瘤免疫浸潤水平間的相關(guān)性。

1.2.5 cBio-Portal 數(shù)據(jù)庫分析MCM8 基因的共表達網(wǎng)絡(luò) 分析cBio-Portal 數(shù)據(jù)庫（www. cbioportal.org）中的胃癌患者數(shù)據(jù)，分析時選擇Stomach Adeno?carcinoma（TCGA，F(xiàn)irehose Legacy），分析其mRNA表達（RNASeqV2 RSEM 分析），提取MCM8 的共表達（Co-expression）基因。隨后將MCM8 的共表達基因輸入David 數(shù)據(jù)庫（https：/ /david. ncifcrf. gov/），對其進行生物學(xué)進程（Biological Progress）、細胞組分（celluar component）、分子功能（Molecular Func?tion）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge?nomes）pathway 分析，以探討 MCM8 在胃癌中的細胞定位及其參與的生物學(xué)過程和信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 STRING、GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析 MCM8 的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)性 基于cBio-Portal 篩選到的 MCM8 相關(guān)基因，結(jié)合 STRING 數(shù)據(jù)庫（https：/ /string-db.org/）分析MCM8 的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI network），并通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http：/ /gepia.cancer-ku.cn/）進一步驗證該網(wǎng)絡(luò)中的蛋白與MCM8間的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 Oncomine 數(shù)據(jù)庫的研究結(jié)果中紅色越深表示MCM8 在該芯片中表達越高，藍色越深表示MCM8 在該芯片中表達越低。GSE27342 數(shù)據(jù)集獲取的胃癌及其相對應(yīng)的癌旁組織中MCM8基因表達水平的比較采用配對t檢驗。臨床標(biāo)本免疫組化陽性染色的IOD 的比較采用t檢驗。采用Ka?plan-Meier 生存曲線和 Log-rank 檢驗分析 MCM8 基因表達量與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCM8 基因在人類常見類型的腫瘤中過度表達 Oncomine 數(shù)據(jù)庫分析MCM8 基因在人類常見類型腫瘤和正常組織中的表達差異結(jié)果顯示：MCM8 基因在人胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、淋巴瘤、頭頸部和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中過度表達（圖1）。

圖1 MCM8在人類多數(shù)腫瘤中高表達Fig.1 MCM8 was overexpressed in most human tumors

2.2 MCM8 基因在胃癌組織中過表達 GEO、TC?GA 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示：MCM8基因在胃癌組織中的表達量較癌旁組織高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2A、B）；分析MCM8基因表達水平與胃癌患者臨床病理學(xué)參數(shù)間的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)：與中、高分化癌相比，低分化癌患者組織中的MCM8 基因表達水平更低（圖2C），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；MCM8 基因表達水平與胃癌腫瘤分期無顯著相關(guān)性（圖2D）。

圖2 MCM8在胃癌組織中高表達Fig.2 MCM8 was overexpressed in gastric cancer tissues

2.3 免疫組化染色結(jié)果示MCM8 蛋白在胃癌中過表達 30例胃癌和癌旁樣本免疫組化染色結(jié)果如圖3A、B 所示。MCM8 蛋白的陽性表達主要位于胞核內(nèi)，部分胞漿內(nèi)亦有表達，呈棕黃色顆粒樣。在相同的判定標(biāo)準(zhǔn)下，胃癌組織中MCM8 陽性染色部分的IOD 值顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明MCM8蛋白在胃癌組織中過表達（圖3C）。

圖3 胃癌和癌旁組織中MCM8的表達情況（免疫組織化學(xué)染色，×400）Fig.3 Expression of MCM8 protein in gastric cancer and adjacent normaltissues（immunohistochemical staining，×400）

2.4 MCM8基因表達與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān) 通過Kaplan-Meier 數(shù)據(jù)庫分析胃癌患者MCM8 基因表達水平與預(yù)后的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)：MCM8高表達組胃癌患者的OS 顯著低于低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4A）；根據(jù)HER2把胃癌患者分為HER2陰性組和HER2陽性組，分析發(fā)現(xiàn)兩組中MCM8高表達的胃癌患者OS 及PPS 均顯著低于MCM8 低表達者，且在HER2 陰性組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4B、C），而在HER2陽性組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4D、E）。

圖4 MCM8表達與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)Fig.4 MCM8 expression was closely associated with prog?nosis of gastric cancer patients

2.5 MCM8 基因表達水平與胃癌腫瘤免疫浸潤水平密切相關(guān) TISIDB 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示：MCM8基因表達水平與胃癌腫瘤浸潤NK 細胞、B 細胞、DC細胞的表達豐度均呈負相關(guān)，與CD4+T 細胞的表達量呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖5A~D）；而MCM8 基因達水平與CD8+T 細胞表達豐度亦呈負相關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5E）。

圖5 MCM8與胃癌腫瘤免疫浸潤水平的相關(guān)性Fig.5 Correlation of MCM8 expression with immune in?filtration level in gastric cancer

2.6 MCM8 共表達基因的富集分析 按照前述方法從cBio-Portal數(shù)據(jù)庫中篩選到415例胃癌標(biāo)本，其中與MCM8 共表達的基因有20 225 個，以spearman相關(guān)系數(shù)絕對值>0.3 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得2 153 個基因并對其進行g(shù)ene ontology（GO）富集分析及KEGG-pathway 分析。結(jié)果表明：MCM8 主要定位于細胞核內(nèi)，其參與的生物學(xué)進程包括細胞分化、DNA 復(fù)制和修復(fù)、核分裂、染色單體黏附和分離、細胞有絲分裂G1/S 和G2/M 期過渡、蛋白質(zhì)磺酰化、mRNA 和 tRNA 從胞核向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運等；MCM8 的分子功能包括與蛋白質(zhì)、ATP、DNA、RNA、染色質(zhì)、核苷酸的結(jié)合，調(diào)控單鏈DNA 依賴性ATP 酶活性，與DNA 復(fù)制起點結(jié)合等（圖6）。KEGG-pathway 分析結(jié)果顯示MCM8 可能參與細胞周期、RNA 轉(zhuǎn)運及降解、嘌呤和嘧啶代謝、mRNA監(jiān)視、核糖體形成、DNA錯配修復(fù)等的調(diào)節(jié)過程（圖7）。

圖6 MCM8共表達基因的GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis of MCM8 co-expressed gene based on cBio-Portal

圖7 MCM8相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)的KEGG-pathway富集分析Fig.7 KEGG-pathway enrichment analysis of MCM8 in?teracting protein network

2.7 MCM8蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò) 根據(jù)cBio-Portal數(shù)據(jù)庫分析TCGA 胃癌數(shù)據(jù)庫中與MCM8 共表達的基因，結(jié)合STRING 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建MCM8 相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)（圖8A），結(jié)果顯示MCM8 蛋白與CDC、POLA家族的分子密切相關(guān)。通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫進一步驗證上述網(wǎng)絡(luò)中的蛋白與MCM8 間的關(guān)系后，發(fā)現(xiàn)與MCM8 最緊密相關(guān)的蛋白包括POLA1、ORC1、CDC7、CDC45（圖8B~E）。

圖8 MCM8蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)性Fig.8 Network of interaction protein with MCM8 and correlations between them

3 討論

近年來胃癌的發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)上升趨勢，目前根治性胃切除術(shù)是胃癌的唯一治療方法，對局部進展期胃癌進行了完全手術(shù)切除的患者，輔以化療，可將其5 年總生存率（OS）提高10%~15%［19-22］。盡管傳統(tǒng)治療確實為胃癌患者帶來了生存益處，但許多患者在術(shù)后輔助治療后再度復(fù)發(fā)，這表明腫瘤的異質(zhì)性有助于其逃避細胞毒性治療［23］。因此，本文基于生物信息學(xué)分析MCM8 對胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的信號通路及腫瘤微環(huán)境的改變進行研究，以期為胃癌診斷、治療、預(yù)后評估提供新思路。

MCM8 基因包括19 個外顯子，位于20p12.3-13染色體帶處與GCD10 的相對位置，編碼一個由840個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，在DNA 復(fù)制起始、延伸、轉(zhuǎn)錄、染色體重構(gòu)和基因組穩(wěn)定中起重要作用［24］。本研究通過GEO、TCGA 數(shù)據(jù)庫分析了MCM8 在胃癌與癌旁組織中mRNA 水平的差異表達，并收集臨床組織樣本，通過免疫組化染色進一步驗證了其在蛋白水平的表達差異。分析MCM8表達水平與胃癌患者生存率間的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)：MCM8 低表達的胃癌患者，其總體生存率顯著升高；在HER2陰性的胃癌患者中，MCM8 低表達的胃癌患者的OS 及PPS 均有顯著升高，表明MCM8 可以作為HER2 陰性胃癌患者較好的預(yù)后分子診斷標(biāo)志物。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程不僅與腫瘤細胞所發(fā)生分子事件有關(guān)，也與腫瘤微環(huán)境的生物學(xué)環(huán)境有關(guān)，還可以是腫瘤細胞與腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）間相互作用形成［25］。TME 是指與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境，主要由腫瘤細胞以及免疫細胞、內(nèi)皮細胞、細胞因子、多種基質(zhì)細胞、趨化因子等組成［26］。TME 可通過多種機制導(dǎo)致機體對腫瘤的免疫監(jiān)視和免疫耐受失衡，從而促進腫瘤生長。DC細胞是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原。成熟DC能有效激活初始T細胞，處于啟動、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。在腫瘤患者中，DC主要將腫瘤細胞表面分子標(biāo)志物和代謝產(chǎn)物等呈遞給細胞毒性T細胞，進而殺傷腫瘤細胞，近年來作為惡性腫瘤免疫治療因子被廣泛研究［27-28］。本研究通過TISIDB 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)MCM8的表達與腫瘤浸潤DC 細胞表達豐度呈負相關(guān)，表明MCM8 可能通過改變TME 參與機體對腫瘤免疫監(jiān)視的逃避過程。腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infil?trating lymphocytes，TILs）是 TME 的主要成分之一，是存在于腫瘤間質(zhì)中的一類異質(zhì)性淋巴細胞群，以T 細胞、B 細胞和NK 細胞為代表，近年來被用于腫瘤的過繼免疫治療。研究表明，高浸潤豐度的TILs是宿主高效抗腫瘤免疫應(yīng)答的體現(xiàn)，是預(yù)后良好的指標(biāo)［29］。本研究發(fā)現(xiàn)MCM8表達量與腫瘤CD8+T 細胞、B 細胞、NK 細胞浸潤豐度呈負相關(guān)，表明MCM8基因高表達的胃癌患者預(yù)后較差，這與前面對MCM8基因表達量與胃癌患者總體生存率的分析結(jié)果相一致。有學(xué)者指出，分化程度高、直徑<5 cm 的胃癌患者，其腫瘤浸潤CD4+T 細胞表達豐度明顯高于分化差、直徑≥5 cm 的胃癌患者［30］。因此，本研究中MCM8表達量與腫瘤微環(huán)境中CD4+T細胞表達豐度呈正相關(guān)的結(jié)論應(yīng)結(jié)合胃癌患者的腫瘤分級、瘤體大小進一步細化。若以MCM8 作為治療靶點，理論上不僅可顯著提高胃癌患者的OS，還可提高腫瘤浸潤 CD8+T 細胞、B 細胞、NK 細胞、DC 細胞的表達豐度，亦有利于胃癌患者的過繼免疫治療。

綜上所述，MCM8可以作為胃癌診斷、預(yù)后評估的一個良好的生物學(xué)標(biāo)志物，具有很好的應(yīng)用前景，后續(xù)本課題組將繼續(xù)通過體外細胞實驗結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進一步驗證上述結(jié)論。