李 純 張 青 魏 巍 （大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院，大連116001）

宮頸鱗狀細(xì)胞癌（cervical squamous cell carcino?ma，CSCC）嚴(yán)重威脅女性健康，每年可導(dǎo)致幾十萬(wàn)例患者死亡［1］。早期宮頸癌患者建議采取手術(shù)治療，但晚期患者現(xiàn)有治療手段療效較差［2］。目前，國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)FIGO 分期是CSCC 最重要的預(yù)后因素，但無(wú)法反映CSCC 的生物學(xué)異質(zhì)性。因此，識(shí)別與CSCC 預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)個(gè)體化治療對(duì)患者尤其是晚期患者極為重要。免疫治療是癌癥個(gè)性化診療的主要驅(qū)動(dòng)力，是新的宮頸癌治療模式［3］。但免疫相關(guān)基因（immune related genes，IRGs）在宮頸癌臨床相關(guān)性和預(yù)后中的意義尚未闡明。因此，本研究擬基于宮頸癌的IRGs構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型，對(duì)宮頸癌患者進(jìn)行分組，系統(tǒng)分析IRGs與預(yù)后的相關(guān)性，深入了解IRGs對(duì)宮頸癌預(yù)后的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值，為宮頸癌靶向治療提供新的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 材料 從TCGA 和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)下載268 例CSCC臨床樣本的mRNA數(shù)據(jù)和臨床信息，其中包含255例腫瘤標(biāo)本和13例非腫瘤標(biāo)本。通過(guò)免疫學(xué)數(shù)據(jù) 庫(kù) 和 分 析 門 戶 TCIA 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：/ /tcia. at/home）下載IRGs。

1.2 方法

1.2.1 差異基因分析 采用limma 包以FDR<0.05和|log2（FC）|>1 為閾值對(duì)所有轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選所有差異IRGs。采用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)行GO和KEGG功能富集分析。

1.2.2 生存分析及TFs 的調(diào)控 通過(guò)單因素COX回歸分析與生存相關(guān)的IRGs。從STRING 在線數(shù)據(jù)庫(kù)提取臨床相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（TFs），通過(guò)Cytoscape 軟件構(gòu)建IRGs 和TFs 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探討TFs 和轉(zhuǎn)錄組的調(diào)控聯(lián)系。

1.2.3 建立免疫相關(guān)基因的預(yù)后模型 基于多因素COX 回歸分析整合的IRGs 作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，以IRGs 表達(dá)數(shù)×Cox 回歸系數(shù)構(gòu)建預(yù)后模型。將患者按中位PI 值分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，評(píng)估不同宮頸癌患者PI 的預(yù)后價(jià)值。分別采用單因素和多因素COX 回歸評(píng)估臨床變量及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者預(yù)后的相關(guān)性，判斷風(fēng)險(xiǎn)模型可否作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。采用Kaplan-Meier 曲線法分析高、低風(fēng)險(xiǎn)組OS，采用受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)估模型的預(yù)測(cè)性能。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 通過(guò)R 軟件包計(jì)算生存ROC AUC，采用獨(dú)立t檢驗(yàn)檢驗(yàn)臨床參數(shù)差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)IRGs 及功能富集分析 limma 包共識(shí)別出293 個(gè)差異表達(dá)IRGs，其中105 個(gè)下調(diào)基因和188 個(gè)上調(diào)基因（圖1A）。對(duì) 293 個(gè)IRGs 進(jìn)行GO和KEGG 分析，GO 詞條中，生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）富集最為豐富的分別是regulation of leukocyte activation、side of membrane、cytokine receptor binding。KEGG 功能富集分析主要富集于NF-κB、細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞-細(xì)胞受體相互結(jié)合等信號(hào)通路（圖1B）。

圖1 差異表達(dá)的IRGsFig.1 Differentially expressed IRGs

2.2 預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)IRGs 鑒定 單因素COX回歸分析顯示，有33 個(gè)差異表達(dá)IRGs 與患者OS 相關(guān)（圖2A），包括24 個(gè)低風(fēng)險(xiǎn)基因及9 個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)基因。將上述33個(gè)基因進(jìn)行多因素Cox分析，篩選出7 個(gè) IRGs 與 OS 相 關(guān) ，其 中 FOXP3、ANKRD22 和FRAT2 與 OS 呈正相關(guān)，而 CCL20、NRP1、CXCL1 和SPP1與OS呈負(fù)相關(guān)（圖2B）。

圖2 預(yù)后相關(guān)IRGsFig.2 Prognosis related IRGs

2.3 建立免疫相關(guān)基因的預(yù)后模型及生存分析 基于以上7個(gè)IRGs表達(dá)譜構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，風(fēng)險(xiǎn)值（PI）＝（CCL20×0.128 7）+［FOXP3×（? 0.765 7）］+（NRP1×0.435 3）+［ANKRD22×（?0.287 4）］+［FRAT2×（?0.369 3）］+（CXCL1×0.149 1）+（SPP1×0.228 7），計(jì)算各患者PI 值，以 PI 中位數(shù)為截?cái)嘀?，將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。與高風(fēng)險(xiǎn)組相比，低風(fēng)險(xiǎn)組平均OS 較長(zhǎng)，死亡數(shù)明顯減少。熱圖顯示，7個(gè)IRGs在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中的表達(dá)值存在明顯差異（圖3A）。此外，Kaplan-Meier生存分析提示，高風(fēng)險(xiǎn)組患者OS顯著縮短（P=6.116e-11，圖3B）。

圖3 基于IRGs的預(yù)后模型Fig.3 Prognostic model based on IRGs

2.4 生存影響因素的Cox 回歸分析 對(duì)年齡、FI?GO 分期、分級(jí)及風(fēng)險(xiǎn)值與OS 的相關(guān)性進(jìn)行單因素和多因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示，預(yù)后模型風(fēng)險(xiǎn)值是OS 的獨(dú)立預(yù)后因素且為高風(fēng)險(xiǎn)因素（P<0.001，圖4）。

圖4 宮頸癌OS預(yù)后因素的回歸分析Fig.4 Regression analysis of cervical cancer prognostic factors for OS

2.5 IRGs 臨床相關(guān)性分析 對(duì)7 個(gè)IRGs、風(fēng)險(xiǎn)值與臨床變量，如年齡、FIGO分期、分級(jí)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，ANKRD22、CCL20 在grade3-4 中低表達(dá)；SPP1 與 riskScore 在stage3~4 中高表達(dá)（P<0.05，圖5）。表明以上IRGs在預(yù)后預(yù)測(cè)方面具有一定價(jià)值。

圖5 IRGs表達(dá)與臨床變量相關(guān)性分析Fig.5 Relationships between IRGs expression and clinico?pathological factors

2.6 TFs 網(wǎng)絡(luò)圖 為探討預(yù)后相關(guān)差異表達(dá)IRGs的潛在分子機(jī)制，檢測(cè)318 個(gè)TFs 表達(dá)譜，篩選出99 個(gè)差異表達(dá) TFs 與 CSCC 相關(guān)（圖 6A）。對(duì) 99 個(gè)TFs 與33 個(gè)預(yù)后相關(guān)差異IRGs 進(jìn)行相關(guān)性分析，構(gòu)建6 個(gè)TFs 和24 個(gè)預(yù)后相關(guān)差異IRGs 的網(wǎng)絡(luò)圖（CorFilter>0.3，圖6B）。

圖6 TFs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig.6 TFs regulatory network

3 討論

CSCC 是女性常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年上升［4］。本研究共篩選出293個(gè)差異表達(dá)IRGs，KEGG分析發(fā)現(xiàn)，以上IRGs 主要富集于NF-κB 通路。NF-κB 信號(hào)途徑在免疫調(diào)節(jié)及腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用，被認(rèn)為是導(dǎo)致宮頸癌HPV 持續(xù)感染的重要因素［5］。COX 回歸構(gòu)建 7 個(gè) IRGs 預(yù)后模型，將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，兩組患者OS差異顯著，且模型風(fēng)險(xiǎn)值是OS 的獨(dú)立預(yù)后因素，表明IRGs 預(yù)后模型對(duì)CSCC預(yù)后評(píng)估及個(gè)體化治療有重要意義。

預(yù)后模型中，F(xiàn)OXP3、ANKRD22 和 FRAT2 表達(dá)與OS呈正相關(guān)，屬低風(fēng)險(xiǎn)IRGs。熊潔［6］發(fā)現(xiàn)FOXP3在高-中分化組中陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于低分化組，且與患者年齡分期無(wú)關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ANKRD22 與分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，在前列腺癌中ANKRD22 表達(dá)與分期呈負(fù)相關(guān)，具有保護(hù)作用［7］。FRAT2 是 WNT 信號(hào)通路的正調(diào)控因子，通過(guò)激活WNT信號(hào)通路參與腫瘤發(fā)生［8］。

此外，本研究中 CCL20、NRP1、CXCL1 和 SPP1與患者OS 呈負(fù)相關(guān)，屬高風(fēng)險(xiǎn)IRGs。宮頸癌組織中CCL20表達(dá)明顯增高，并與宮頸癌復(fù)發(fā)相關(guān)［9］；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CCL20/CCR6 可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移［10］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，抑制 NRP-1 基因表達(dá)可降低宮頸癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其表達(dá)與癌細(xì)胞活性呈正相關(guān)［11］。血清CXCL1 表達(dá)在宮頸癌患者中明顯升高，與宮頸癌血管生成相關(guān)，并可誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖和克隆形成［12-13］。研究報(bào)道，SPP1 與宮頸癌發(fā)生有關(guān)，在 CSCC 中顯著上調(diào)［14］。CHEN 等［15］采用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)，SPP1在宮頸癌組織和細(xì)胞系中呈高表達(dá)，抑制SPP1 表達(dá)可抑制HeLa 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，增加順鉑敏感性。本研究中，CCL20、NRP1 CXCL1 和 SPP1 在 CSCC 組織中呈高表達(dá)，是宮頸癌的危險(xiǎn)因素，與既往研究結(jié)論相符。

本研究構(gòu)建了1 個(gè)TFs 與IRGs 網(wǎng)絡(luò)圖，其中STAT1、TP63、、BATP 等 TFs 在該網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要位置。STAT1在CSCC中有重要意義，STAT1在惡性腫瘤組織中表達(dá)顯著增加［16］。此外，TP63基因甲基化率在宮頸癌組織中顯著升高［17］。文獻(xiàn)顯示，BCL11A在宮頸癌組織中高表達(dá)且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［18］。Sox2 在宮頸鱗癌中高表達(dá)，并可促進(jìn)宮頸癌進(jìn)展［19］。但BATP和IRF5在宮頸癌中的作用有待進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出7個(gè)與預(yù)后顯著相關(guān)的IRGs，基于以上7個(gè)IRGs 構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)模型將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，且獨(dú)立于其他臨床變量預(yù)測(cè)患者預(yù)后，為CSCC 預(yù)后預(yù)測(cè)及免疫相關(guān)個(gè)性化治療方案制定提供依據(jù)。