唐媛 李丹 錢紅梅 陳燕燕，3 秦蕾 池在龍，3

復(fù)用眼科手術(shù)器械的清洗必須使用清洗劑，而正確使用清洗劑可提高眼科手術(shù)器械的清洗效果。醫(yī)用多酶清洗劑對有機物具有高效的去除效果，現(xiàn)已成為復(fù)用眼科手術(shù)器械清洗的首選。本課題組前期對全國127家醫(yī)院的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有超過60%的醫(yī)院在清洗眼科手術(shù)器械時使用醫(yī)用多酶清洗劑[1]。一旦有醫(yī)用多酶清洗劑殘留，即使非常微量也會帶來嚴重的眼部術(shù)后并發(fā)癥。Parikh等[2]發(fā)現(xiàn)殘留的醫(yī)用多酶清洗劑可能導(dǎo)致角膜水腫和眼內(nèi)炎癥。多名學(xué)者研究報道醫(yī)用多酶清洗劑殘留于眼科手術(shù)器械可能會導(dǎo)致眼前節(jié)毒性反應(yīng)綜合征（Toxic anterior segment syndrome，TASS）的發(fā)生[3-5]。因此，為確保眼科手術(shù)的安全，有必要對眼科臨床常用的醫(yī)用多酶清洗劑進行科學(xué)可靠的檢測和定量分析。

但目前臨床上還沒有一種針對醫(yī)用多酶清洗劑殘留的科學(xué)的定量檢測方法，查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻及指南[6-10]，均未發(fā)現(xiàn)醫(yī)用多酶清洗劑殘留的定量檢測方法。本研究采用二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）法對醫(yī)用多酶清洗劑殘留進行定量檢測，驗證該方法的重復(fù)性、準確性、回收率，為多酶洗滌用品在眼科臨床上更加安全規(guī)范的使用提供依據(jù)和保證。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

醫(yī)用多酶清洗劑：主要有效成分包括脂肪酶、蛋白酶、糖酶、淀粉酶、高級蛋白水解酶、協(xié)同酶和生化酶等（Endozime KWZ035001 XBJ1，美國魯沃夫公司）；BCA試劑盒（P0009，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；醫(yī)療器械干燥箱（LWYL-400D，重慶優(yōu)瑪醫(yī)療科技有限公司）；96孔板（廣州潔特生物過濾股份有限公司）；酶標儀（Spectramax M5，上海美谷分子儀器公司）；生化培養(yǎng)箱（SPX-150B-Ⅱ，上海躍進醫(yī)療器械公司）。

1.2 方法

1.2.1 BCA工作液及標準液的配制 參照BCA試劑盒說明書，將A液和B液以50∶1 的比例充分混勻，配制得到BCA工作液。將25 mg/ml的蛋白標準（Bovine serum albumin，BSA）稀釋至0.5 mg/ml，用滅菌水對其梯度稀釋，配制成濃度梯度分別為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/ml的BCA系列標準液。每次實驗現(xiàn)配現(xiàn)用，繪制標準回歸曲線和計算回歸方程。

1.2.2 醫(yī)用多酶清洗劑樣品的配制 將醫(yī)用多酶清洗劑原液分別按1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300的比例與純水混合，配制成各濃度梯度的醫(yī)用多酶清洗劑樣品。

1.2.3 BCA法測定步驟 在96孔板中依次加入200 μl的BCA工作液，再依次加入BCA系列標準液和檢測樣品20 μl，充分混勻后，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育30 min后取出，用酶標儀測定標準液和樣品在562 nm波長處的吸光度。以蛋白濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線和樣品的吸光度計算出所測樣品的蛋白濃度。

1.2.4 BCA測量的方法學(xué)考察 BCA標準曲線的重現(xiàn)性試驗：于不同時刻配制BCA系列標準液，測定吸光度，繪制標準曲線并計算其回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2）。

BCA法回收試驗：取濃度為100、500 μg/ml的標準蛋白各20 μl與200 μl的BCA工作液混勻，于37 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育30 min，重復(fù)8次，分別測定100、500 μg/ml蛋白水平的回收率。

BCA法定量醫(yī)用多酶清洗劑中的酶蛋白濃度試驗：取醫(yī)用多酶清洗劑原液、1∶50 及1∶100 稀釋的醫(yī)用多酶清洗劑樣品，各8份，根據(jù)標準曲線和樣品的吸光度求取所測樣品的蛋白濃度，計算相應(yīng)的標準偏差系數(shù)（Relative standard deviation，RSD）。

BCA法定量不同稀釋比例醫(yī)用多酶清洗劑中的酶蛋白濃度變化試驗：取適量醫(yī)用多酶清洗劑原液，1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300稀釋的醫(yī)用多酶清洗劑樣品，每個樣品測量3次取均值，通過標準曲線求得各樣品中的酶蛋白濃度，繪制不同稀釋比例醫(yī)用多酶清洗劑中的酶蛋白濃度變化柱狀圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗研究。采用EpiData 3.1 建立數(shù)據(jù)庫進行平行雙錄入，同時建立核查文件，進行計算機邏輯核查。采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。本研究計量指標數(shù)據(jù)資料采用均數(shù)（Mean）、標準差（Standard deviation，SD）、標準偏差（Relative standard deviation，RSD）進行統(tǒng)計描述。本研究規(guī)定RSD＜5%。BCA標準曲線的計算采用最小二乘法進行線性相關(guān)與回歸分析，本研究規(guī)定每條標準曲線波長的R2＞0.95。

2 結(jié)果

2.1 BCA標準曲線的繪制

用酶標儀測定蛋白標準液在562 nm處的OD值，根據(jù)測定結(jié)果繪制標準曲線（見圖1），顯示OD 值與標準蛋白濃度呈正相關(guān)，回歸方程為=0.0009X+0.0955，相關(guān)系數(shù)R2=0.9995。

2.2 BCA法的準確性實驗

2.2.1 BCA標準曲線的重現(xiàn)性試驗 于不同時刻配制BCA系列標準液，共制作5次標準曲線（見表1），相關(guān)系數(shù)R2均＞0.95，可見波長為562 nm時，在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系且重復(fù)性好。

圖1.二喹啉甲酸法標準曲線Figure 1.BCA Standard curve.

表1.二喹啉甲酸法標準曲線回歸方程與R2值Table 1.Regression equation of the standard curve of BCA and R2 value

2.2.2 BCA法回收試驗 濃度為100、500 μg/ml的標準蛋白通過BCA 法測定的回收率分別為104.6%～112.8%、96.7%～102.2%，平均回收率分別為109.2%、99.8%，RSD分別為2.518%、2.123%。2種標準蛋白濃度測定的回收率RSD均＜3%（見表2），表明BCA法在樣品處理過程中損失少，重復(fù)性好，具有良好的準確性和可靠性，測定蛋白質(zhì)濃度有較高的可信度。

2.3 BCA法定量分析醫(yī)用多酶清洗劑中的酶蛋白濃度

測定吸光度，依據(jù)標準曲線計算醫(yī)用多酶清洗劑樣品中的酶蛋白濃度。未稀釋原液，1∶50、1∶100比例稀釋醫(yī)用多酶清洗劑樣品中平均酶蛋白濃度依次為611、39、25 μg/ml，標準差依次為20.591、1.872、0.927 μg/ml，RSD依次為3.372%、4.832%、3.730%，3 組樣品中的酶蛋白濃度的RSD均＜5%，說明BCA法檢測醫(yī)用多酶清洗劑中的酶蛋白濃度具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。見表3。

2.4 BCA法定量不同稀釋比例醫(yī)用多酶清洗劑中酶蛋白的濃度變化

將醫(yī)用多酶清洗劑稀釋成6 個不同濃度梯度，結(jié)果顯示稀釋比例在1∶50～1∶200范圍內(nèi)，酶蛋白濃度隨著醫(yī)用多酶清洗劑稀釋比例的增大而呈線性下降（見圖2），將622 μg/ml的醫(yī)用多酶清洗劑原液稀釋至1∶200及以上時，酶蛋白濃度接近穩(wěn)定。

表2.100 μg/ml和500 μg/ml標準蛋白的回收率測定結(jié)果Table 2.Recoveries of 100 and 500 μg/ml standard protein

表3.醫(yī)用多酶清洗劑中酶蛋白濃度的定量分析結(jié)果Table 3.Quantitative analysis of enzyme protein concentration in medical multi-enzyme detergent

圖2.醫(yī)用多酶清洗劑不同比例稀釋后的酶蛋白濃度變化趨勢圖采用的標準曲線為 Y^=0.0008X+0.1011，R2=0.9995Figure 2.Trend of enzyme protein concentration after different ratio dilution of medical multi-enzyme detergent.Linear regression equation of BCA standard curve is =0.0008X+0.1011,R2=0.9995.

3 討論

眾所周知，殘留的醫(yī)用多酶清洗劑可致使眼內(nèi)炎、TASS等嚴重的眼部疾病。如何對醫(yī)用多酶清洗劑殘留進行精確可靠的定量檢測成為臨床上面臨的一大難題。目前，醫(yī)用多酶清洗劑的檢測方法有定量和定性檢測，以定性檢測為主，如電泳法[11]及化學(xué)一般顯色法等。有學(xué)者采用掃描電鏡法（Scanning electron microscopy，SEM）結(jié)合能量色散X射線光譜分析（Energy dispersive spectroscopy，EDS）[12，13]，該法雖可確定醫(yī)用多酶清洗劑中蛋白的元素組成，但因設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，目前仍停留于實驗研究階段。也有學(xué)者提出總有機碳檢測法（Total organic carbon，TOC）[14]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]，雖可定量估算醫(yī)用多酶清洗劑中的蛋白含量，但因?qū)嶒炛芷陂L且存在不確定性，因此不適合在臨床開展。

BCA法通過測量吸光度來確定蛋白質(zhì)的含量，已成為一種常用的定量檢測蛋白質(zhì)的方法[16]，而常見的醫(yī)用多酶清洗劑中的酶本質(zhì)就是蛋白質(zhì)。本研究首次將BCA法應(yīng)用于醫(yī)用多酶清洗劑的定量檢測中，基于大量的實驗，證實采用BCA法來檢測醫(yī)用多酶清洗劑殘留時具有良好的重復(fù)性、準確性及回收率（見圖1 和表1 ─3）。圖2 表明醫(yī)用多酶清洗劑在臨床使用過程中，最佳配比濃度為1∶200～1∶300，這與該清洗劑說明書要求的配比濃度（1∶270）相似。在此范圍內(nèi)，醫(yī)用多酶清洗劑含有相似的酶蛋白濃度，對手術(shù)器械具有穩(wěn)定的清潔功效。

綜上所述，本研究證明BCA法不僅可以通過目測試劑顏色的變化來快速作出定性判斷，還可以通過紫外分光光度計或酶標儀的檢測來定量分析醫(yī)用多酶清洗劑的濃度。且BCA法在臨床應(yīng)用過程中具有成本低廉、操作簡單、方便快捷、適用性強等優(yōu)點，為醫(yī)用多酶清洗劑殘留的定量檢驗技術(shù)標準的建立提供新的思路，填補了指南和規(guī)范的缺陷，可推薦應(yīng)用于臨床工作，實時監(jiān)測清洗后臨床眼科手術(shù)器械表面醫(yī)用多酶清洗劑的殘留情況，預(yù)防和控制醫(yī)源性感染的發(fā)生。本研究也存在著一定的不足，多酶清洗劑成分復(fù)雜，可能存在一些影響B(tài)CA法定量測定的物質(zhì)，如蛋白增敏劑[17]、還原性物質(zhì)[18，19]。在本項研究中，這些干擾物質(zhì)未被去除。我們將在后續(xù)實驗中通過沉淀蛋白質(zhì)[20]和調(diào)整樣品pH值[21]等方法，有效消除多酶清洗劑中各干擾物質(zhì)對BCA法測定結(jié)果的影響，從而更精準地測定多酶清洗劑中酶蛋白的濃度。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻聲明唐媛：收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計及資料的分析和解釋；撰寫論文；根據(jù)編輯部的修改意見進行修改。李丹、錢紅梅、秦蕾：參與選題、設(shè)計、資料的分析和解釋，修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進行核修。陳燕燕、池在龍：參與選題、設(shè)計和修改論文的結(jié)果、結(jié)論