陳伯斯，高 尚，張宏斌，王堂花，楊汶菱

（海鴻農(nóng)牧（廣州）有限公司，廣東 廣州510000）

馬立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）是少數(shù)幾種能在自然宿主中誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤的皰疹病毒之一，屬于皰疹病毒科皰疹病毒亞科。由其引起雞馬立克氏病可以普遍發(fā)生在病雞的各種組織和器官中，以外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤(rùn)和包括虹膜、皮膚在內(nèi)的各種器官和組織的單核細(xì)胞浸潤(rùn)、腫大，進(jìn)而形成腫瘤為主要特征，給雞群帶來(lái)的發(fā)病率一般為1%～30%不等，有時(shí)甚至可高達(dá)60%。

在現(xiàn)在以及可預(yù)見(jiàn)的未來(lái)，疫苗接種是防控MD的中心策略。隨著MDV毒力在過(guò)去幾十年間的不斷增強(qiáng)，致使疫苗的使用也在發(fā)生改變，HVT等凍干苗使用量在不斷減少。目前，國(guó)內(nèi)廣泛使用的馬立克氏病活疫苗主要包括CVI988-Ris pens株及814株。雖然馬立克氏病活疫苗的免疫已經(jīng)相對(duì)成熟，但臨床免疫中卻往往出現(xiàn)免疫失敗的現(xiàn)象。本文通過(guò)814株的病例追蹤并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，總結(jié)了該疫苗免疫失敗的原因，為同行免疫該疫苗提供依據(jù)。

1 疫苗及稀釋液的保存運(yùn)輸

由于馬立克氏病病毒是一種嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合性病毒，所以由其制成的活疫苗，必須嚴(yán)格保存在－196℃的液氮中，任何使得疫苗暴露在液氮之外的操作都會(huì)引起疫苗溶解而失效。這就要求疫苗在運(yùn)輸過(guò)程中必須保證液氮罐直立狀態(tài)，并減少碰撞。接收疫苗的第一時(shí)間，需要檢查液氮面是否位于疫苗之上，否則棄用。由于在日常使用中需要反復(fù)打開(kāi)液氮罐口，導(dǎo)致液氮揮發(fā)，為保證疫苗質(zhì)量，日常管理中需要及時(shí)檢查液氮高度并添補(bǔ)液氮。

稀釋液作為稀釋疫苗的溶液，可避光常溫保存。因其具備很高的營(yíng)養(yǎng)成分，容易受到病原微生物的污染，所以在運(yùn)輸及保存過(guò)程中需要嚴(yán)格篩除包裝破損、溶液渾濁變色的稀釋液。目前，不同廠家稀釋液的配制方法不同，對(duì)疫苗的保護(hù)效果也不同。以科前生物公司的馬立克氏病疫苗（814株）專用稀釋液為例，稀釋配套疫苗40min后檢測(cè)效價(jià)，疫苗的損失率在5%之內(nèi)，而改變配方成分的稀釋液和進(jìn)口稀釋液在稀釋完疫苗的40min內(nèi)，疫苗的損失率在30%～50%。可見(jiàn)為保證免疫效果，切不可混用不同廠家的稀釋液。

2 疫苗免疫

2.1 免疫前準(zhǔn)備

在免疫前，需要檢查疫苗的規(guī)格。目前馬立克氏病（814株）疫苗具備2000羽/瓶及1000羽/瓶?jī)煞N規(guī)格，若將1000羽份規(guī)格錯(cuò)當(dāng)2000羽份使用，則會(huì)造成免疫的蝕斑數(shù)降低，引起免疫失敗。取出規(guī)范保存的疫苗后，首先需要觀察安瓿瓶瓶身的完整性，對(duì)出現(xiàn)瓶身不完整疫苗，應(yīng)當(dāng)廢棄處理。若觀察發(fā)現(xiàn)安瓿瓶小頭端有疫苗殘留，說(shuō)明該瓶疫苗出現(xiàn)凍融情況，也應(yīng)廢棄處理。稀釋液則檢查包裝完整性及液體是否澄清，若是冷藏保存，則應(yīng)在稀釋前回溫至37℃。

取出的疫苗應(yīng)立即放入預(yù)先調(diào)好的37℃水浴鍋中溶解，整個(gè)過(guò)程控制在5s左右。手指捏住安瓿瓶小頭端，按一個(gè)方向做緩速圓周劃動(dòng)，使疫苗受熱均勻溶解，并在45s內(nèi)溶解完疫苗。使用5mL注射器吸取3mL稀釋液，再緩慢吸出疫苗并注入稀釋液中。反復(fù)3次吸取稀釋液洗滌瓶身，以減少疫苗損失。從取出疫苗到稀釋完成，整個(gè)過(guò)程應(yīng)控制在2min以內(nèi)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)降低疫苗效價(jià)。

2.2 免疫操作

免疫過(guò)程的時(shí)間長(zhǎng)短決定了免疫的效果。有研究表明，室溫存放時(shí)間對(duì)馬立克氏?。?14）疫苗的蝕斑單位及病毒存活率有影響，存放時(shí)間越長(zhǎng)，容易造成免疫失敗。馬立克氏?。?14）液氮疫苗生產(chǎn)廠家對(duì)2000羽份規(guī)格疫苗不同存放時(shí)間下的蝕斑單位計(jì)數(shù)及病毒存活率進(jìn)行比較試驗(yàn)。結(jié)果表明，室溫存放超過(guò)45min即對(duì)疫苗蝕斑單位及病毒存活率造成很大影響（見(jiàn)表1）。

表1 室溫存放MD疫苗的蝕斑單位計(jì)數(shù)及病毒存活率

因此，針對(duì)2000羽份規(guī)格的疫苗免疫時(shí)間應(yīng)控制在45min內(nèi)，1000羽份規(guī)格的疫苗免疫時(shí)間應(yīng)控制在30min以內(nèi)。在免疫過(guò)程中，細(xì)胞的沉降特性會(huì)使細(xì)胞逐漸向疫苗瓶的底部沉降，為保證免疫的均一性，需要在免疫過(guò)程中每隔10min輕輕搖晃疫苗瓶，以維持細(xì)胞的均勻懸浮。同時(shí)，免疫部位位于雛雞的頸背部皮下，漏打錯(cuò)打均會(huì)引起免疫失敗甚至雛雞的死亡，需要定期對(duì)操作人員進(jìn)行培訓(xùn)。

3 抗生素添加

現(xiàn)場(chǎng)臨床經(jīng)驗(yàn)表明，疫苗免疫操作問(wèn)題，會(huì)使疫苗部分或全部失效，這是當(dāng)下免疫失敗的重要原因。此外，多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)在疫苗中添加抗生素的例子已不罕見(jiàn)。但有些抗生素能夠改變稀釋液的滲透壓和pH值，加快疫苗的滅活。根據(jù)武漢科前生物有限公司實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果分析，受試抗生素絕大多數(shù)能夠?qū)︸R立克氏?。?14）疫苗產(chǎn)生影響，且不同廠家生產(chǎn)的同種抗生素影響效果不同（見(jiàn)表2）。

表2 不同抗生素對(duì)馬立克氏病（814）疫苗效價(jià)的影響

本廠曾送檢丁胺卡那霉素至實(shí)驗(yàn)室，以檢測(cè)其對(duì)疫苗的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稀釋液在加入該抗生素后明顯變黃（見(jiàn)圖1），pH值與滲透壓明顯變化，蝕斑單位影響較大（見(jiàn)表3）。

表3 丁胺卡那霉素對(duì)馬立克氏病活疫苗（814株）的影響

圖1 丁胺卡那霉素加入至稀釋液后表觀變化

因此，為確保免疫效果，在添加抗生素前，應(yīng)送至相關(guān)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，選擇影響效果較小的抗生素使用。

4 遺傳背景

家禽的抗性以及抗病特征早在上世紀(jì)30年代就被育種科學(xué)家認(rèn)知，但對(duì)于抗病力的研究遠(yuǎn)落后于經(jīng)濟(jì)性狀的研究。對(duì)雞抗MD的研究，主要集中在主要組織相容性復(fù)合體（MHC）上。MHC是存在于脊椎動(dòng)物的染色體上，編碼主要組織相容性抗原、控制細(xì)胞間的相互識(shí)別以及調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的一組緊密連鎖基因群。研究證實(shí)，MHC分子在動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，其不同單倍型與動(dòng)物疾病的抵抗力和生產(chǎn)性能有著密切的聯(lián)系。Hansen通過(guò)血型B19和B21組合雜交，感染MD后發(fā)現(xiàn)B21為優(yōu)勢(shì)基因。Briles等也通過(guò)試驗(yàn)證明B21單倍型的抗病力最強(qiáng)。Bacon指出：在抗馬立克氏病中，抗性最強(qiáng)的是B21單倍型，中等抗力的的是B2、B6單倍型。易感的是B5、B13及B19單倍型。有研究通過(guò)選取24個(gè)雞種進(jìn)行目標(biāo)捕獲測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了其與MD的抗性關(guān)系（見(jiàn)表4）。

表4 不同雞種的MHC單倍型及與MD抗性關(guān)系

上表顯示了不同雞種對(duì)MD的不同抗性，提示易感及中等抗性雞種相對(duì)強(qiáng)抗性雞種更易感MD。同時(shí)，大部分地方雞種含有B21單倍型，相對(duì)于商業(yè)雞種來(lái)說(shuō)顯示出較強(qiáng)抗性及疾病死亡率，臨床實(shí)際也表明商業(yè)雞種，例如海蘭蛋雞更易感MD，或與遺傳背景有關(guān)。

5 其他因素

在臨床MD免疫失敗經(jīng)驗(yàn)中，除了上述因素外，還有其它因素也在影響著馬立克氏病活疫苗（814株））的免疫效果。筆者通過(guò)追溯免疫失敗案例，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析病死原因，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)病死雞除患有MD外，還并發(fā)有禽白血病、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增值病及肝炎-脾臟腫大綜合癥等免疫抑制疾病。因此，養(yǎng)殖場(chǎng)需要密切關(guān)注免疫抑制疾病的發(fā)生，避免此類疾病降低機(jī)體免疫能力，給MDV的感染提供機(jī)會(huì)。

對(duì)飼養(yǎng)期較短的商品肉雞，由于不易觀察到MD典型癥狀，致使部分肉雞養(yǎng)殖者忽視MD疫苗的重要性，這是造成目前MD疫苗在我國(guó)商品肉雞中流行較為嚴(yán)重的原因之一。調(diào)查顯示，我國(guó)商品肉雞MD死亡率高達(dá)5%，因早期感染MD表現(xiàn)嚴(yán)重免疫抑制或“早期急性死亡綜合癥”的所占比例是20%～25%。這些情況不僅致使雞群生長(zhǎng)緩慢，易患其他疾病，甚至能夠衰弱其他疫苗的免疫效果。而隨著帶毒雞不斷排出羽屑上皮組織，存在于羽毛上皮碎屑中的MDV也隨之增加，從而造成環(huán)境中MDV毒量的累積，甚至出現(xiàn)了超超強(qiáng)毒株（vv+MDV）。目前，超超強(qiáng)毒株能夠突破免疫保護(hù)，引起免疫過(guò)MD的雞群發(fā)生該病，形成免疫失敗。因此，注重馬立克氏病的防制措施及嚴(yán)格的生物安全制度是降低免疫失敗的關(guān)鍵。

6 結(jié)束語(yǔ)

由于MD（814株）疫苗的使用，使我國(guó)暴發(fā)該病的病例在過(guò)去10年間已經(jīng)明顯減少。但疫苗并不能完全防止MD的發(fā)生，多種原因均可以引起免疫失敗。本文揭示臨床免疫M(jìn)D失敗的部分原因，包括疫苗保存運(yùn)輸不當(dāng)、免疫操作不當(dāng)、抗生素影響效果、雞種遺傳背景、免疫抑制病共生及超超強(qiáng)毒株出現(xiàn)。此外，還有疫苗質(zhì)量、母源抗體影響、免疫空白期等其他因素也可以引起免疫失敗。隨著養(yǎng)雞業(yè)集約化程度不斷提高，只有我們重視該病，積極預(yù)防，做好防控的每一環(huán)節(jié)，才能降低免疫失敗比率，營(yíng)造健康的養(yǎng)殖環(huán)境。