鄭圣晗，陳 穎，陳國宏，常國斌

（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009）

主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibil-ity complex，MHC）是一組緊密連鎖高度多態(tài)的染色體基因群，編碼一組重要的與免疫相關(guān)的細(xì)胞膜糖蛋白，廣泛存在于有頜脊椎動(dòng)物中，與宿主的抗病性或免疫應(yīng)答水平密切相關(guān)［1］。1961年Nordskog等［2］將雞的B基因座定義為主要組織相容性復(fù)合體，分為2個(gè)區(qū)域，一個(gè)是含有典型MHC基因的BF/BL區(qū)域和決定紅細(xì)胞抗原的BG區(qū)域，另一個(gè)是遺傳不連鎖的基因簇Y（Restriction fragment polymorphism-Y，Rfp-Y），Y區(qū)與核仁組織區(qū)（Nucleolus organizerregion，NOR）連接［3］。在92 kb的BF/BL核心區(qū)域共有19個(gè)基因，其中包括了CENPA（Centromere protein A，著絲粒蛋白A）基因［4］。

一直以來，疫情是限制養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素，現(xiàn)在控制疾病的主要手段就是進(jìn)行疫苗免疫。但是隨著病毒毒力不斷增強(qiáng)，并不能完全保證免疫雞群不會(huì)受到感染，因此人們開始轉(zhuǎn)向抗病育種的研究。著絲粒是與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖檢查點(diǎn)調(diào)控相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)，參與染色體的移動(dòng)。組成著絲粒的蛋白種類較多，著絲粒蛋白A是最早被發(fā)現(xiàn)的著絲粒家族成員之一，現(xiàn)已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。隨著對(duì)CENPA研究的深入，發(fā)現(xiàn)CENPA在大多數(shù)腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用［5-8］。CENPA的乙?；ㄟ^影響CENPA八聚體結(jié)構(gòu)的核小體來影響有絲分裂，但其詳細(xì)機(jī)制尚不明確。研究還發(fā)現(xiàn)，CENPA與自然流產(chǎn)有關(guān)［9-10］。本研究利用目標(biāo)區(qū)域捕獲測序技術(shù)對(duì)CENPA基因進(jìn)行序列測定，將25個(gè)雞種的CENPA基因序列進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)其SNPs位點(diǎn)和InDel位點(diǎn)，探究不同雞種CENPA等位基因與遺傳抗病力的關(guān)系，為家禽的抗病育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選取的25個(gè)雞種具體情況見表1。

表1 25個(gè)雞品種的具體信息Table1 Specific information of 25 chicken breeds

1.2 測序流程

每個(gè)雞種選取10個(gè)樣本，翅靜脈采血1mL，放入具有肝素鈉的采血管中，然后加入Trizol保存在4℃冰箱中。采取苯酚抽提法提取血液中的DNA，DNA樣品送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲測序。雞的MHC基因長約98 kb，位于16號(hào)染色體上，利用SureSelect Target Enrichment Kit Ion Proton Box 2定制試劑盒并按照Aglient（中國）公司的說明書通過基因組DNA與設(shè)計(jì)的RNA探針雜交完成目標(biāo)區(qū)域捕獲測序。運(yùn)用Illumina HiSeq 2000測序，測序的流程為：首先對(duì)基因組DNA樣本進(jìn)行濃度及完整性的檢測；質(zhì)檢合格后進(jìn)行文庫的構(gòu)建，運(yùn)用超聲破碎技術(shù)將基因組打碎，回收長度約為500 bp的DNA片段，對(duì)兩端進(jìn)行修復(fù)以及加接頭，橋式PCR完成文庫的構(gòu)建；庫檢合格后上機(jī)測序。針對(duì)目標(biāo)捕獲測序結(jié)果的初始數(shù)據(jù)，首先去除reads中的接頭污染，然后將reads中超過50%的低質(zhì)量堿基去除［quality value≤5（E）］，確保分析數(shù)據(jù)的高質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在NCBI網(wǎng)站上檢索出Gallus gallus（GG）的CENPA基因序列，以Gallus_gallus-5.0（GCF_000002 315.4）作為參照，利用MEGA 6.06軟件對(duì)25個(gè)雞種的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，統(tǒng)計(jì)SNPs位點(diǎn)及與之對(duì)應(yīng)的氨基酸變化和InDel位點(diǎn)，選用Construct/Test Neighbor-Joining Tree（NJ）方法構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap的值設(shè)置成1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雞種CENPA基因的SNPs位點(diǎn)和InDel位點(diǎn)分布

從表2中可以看出，CENPA全長共1 925 bp，位于雞的16號(hào)染色體上，處于56 525—58 449的位置，包含了4個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。在25個(gè)不同雞種中CENPA共有31個(gè)SNPs位點(diǎn)，4種缺失和6種插入。4個(gè)外顯子上只有4個(gè)SNPs，沒有插入缺失。5個(gè)內(nèi)含子中只有3個(gè)內(nèi)含子有SNP和InDel，共有27種SNPs，4種插入和6種缺失。由表3可以看出，在4個(gè)外顯子上，25個(gè)雞種累計(jì)只有8個(gè)SNPs。只有7個(gè)雞種在外顯子上有SNPs位點(diǎn)，其他雞種上沒有出現(xiàn)。Exon1和Exon4上的突變都屬于同義突變，并沒有引起氨基酸的改變。Exon2上的突變屬于錯(cuò)義突變，突變?yōu)镃57066T，該突變導(dǎo)致編碼蛋白P變成了蛋白L。由此表明CENPA的外顯子沒有豐富的多態(tài)性，CENPA內(nèi)含子的豐富多態(tài)性體主要現(xiàn)在Intron4上。在Exon3上所有的雞種都沒有SNPs位點(diǎn)和InDel位點(diǎn)，表明CENPA基因在Exon3具有保守性，在雞的進(jìn)化歷史中穩(wěn)定遺傳。

表2 不同雞種CENPA基因的外顯子和內(nèi)含子變化統(tǒng)計(jì)Table 2 The changes of exon and intron in CENPA gene of different chicken breeds

表3 不同雞種CENPA基因上SNPs及對(duì)應(yīng)氨基酸變化Table 3 The changes of SNPs and corresponding am ino acid in CENPA gene of different chicken breeds

2.2 CENPA基因的MEGA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖1所示，25個(gè)雞種大致可被分為4大類，太湖雞（TH）、廣西三黃雞（GXH）、河南斗雞（DJ）和白耳黃雞（BE）聚為一類；羅斯雞（RS）、溧陽雞（LIY）、隱性白羽肉雞（YXB）和藏雞（ZJ）等聚為一類；雪山草雞（XUS）、如皋黃雞（RGH）、北京油雞（BJY）和文昌雞（WC）等聚為一類，狼山雞（LS）、茶花雞（CH）、安卡紅雞（AK）和仙居雞（XJ）等聚為一類。說明中國地方雞品種間的同源性較小，CENPA基因隨著雞的進(jìn)化也逐漸多元進(jìn)化，不同雞種上CENPA基因具有豐富的遺傳多樣性。

圖1 不同雞種CENPA基因的NJ進(jìn)化樹Fig.1 The NJ tree of CENPA gene in different chicken breeds

3 討論

遺傳多樣性一般是指種內(nèi)不同群體之間或一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體之間遺傳變異的總和，對(duì)家禽遺傳多樣性的研究有助于分析家禽的起源進(jìn)化并為抗病育種提供理論依據(jù)。研究結(jié)果顯示，CENPA在Exon2上有錯(cuò)義突變，且只發(fā)生在3個(gè)雞種中，表明Exon2在CENPA基因中起到比較關(guān)鍵的作用。而Exon3在25個(gè)雞種中完全保守，在進(jìn)化中穩(wěn)定遺傳，可作為CENPA的標(biāo)記外顯子。Exon1和Exon4雖然有SNP，但屬于同義突變，故Exon1和Exon4也是保守區(qū)域。CENPA不具有豐富的多態(tài)性，4個(gè)外顯子中有3個(gè)是保守區(qū)域，推測CENPA編碼的是雞的基礎(chǔ)抗病基因。雪山草雞是利用中國優(yōu)質(zhì)地方良種藏雞、茶花雞經(jīng)雜交選育而成的草雞新品種。茶花雞是由野生紅色原雞經(jīng)長期馴化選育而成的，是中國不可多得的原始雞種。雪山草雞具有紅色原雞的血統(tǒng)，但是兩者并不聚在一類。雪山草雞和紅色原雞在Exon2上有相同的SNPs位點(diǎn)，兩者都具有較高的抗病性，表明該SNP位點(diǎn)與雞的優(yōu)良抗病性有一定關(guān)系。

本研究選擇的是普遍使用的NJ樹，通過Bootstrap處理使其能夠很直觀地看出不同雞種間的起源關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，中國地方雞種的雜合度值要明顯高于其他蛋雞、肉雞等商業(yè)品系及歐洲地區(qū)的部分地方品種，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)我國許多地方家禽品種擁有較強(qiáng)的抗病能力和免疫能力［11-15］。羅斯雞、隱性白羽肉雞、來航雞和安卡紅雞屬于國外雞品種，為觀察國外雞種與國內(nèi)雞種的差別，對(duì)國外雞種的聚類情況進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羅斯雞和隱性白羽肉雞聚為一類，來航雞和安卡紅雞各聚在一大類。羅斯雞和隱性白羽肉雞屬于快大型白羽肉雞，安卡紅雞屬于速生型黃羽肉雞，它們的生長速度都很快，但和我國地方黃雞相比，適應(yīng)性和抗病性都更低。在4個(gè)國外雞品種中只有羅斯雞在Exon4上的出現(xiàn)同義突變，大部分雞種在Exon4上沒有SNP和InDel，表明CENPA的Exon4上的SNPs位點(diǎn)無法確定與抗病性是否有關(guān)。我國地方雞種普遍具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抗病性，且分布區(qū)域廣泛，狼山雞、鹿苑雞、溧陽雞、太湖雞和如皋黃雞都是江蘇省內(nèi)的地方雞種，這5個(gè)雞種被分為了4個(gè)大類，表明這5個(gè)雞種之間的同源性較低。其他區(qū)域的雞種也是分類廣泛，表明我國的地方雞品種資源豐富，且之間的同源性較低，大部分雞種擁有較強(qiáng)的抗病性，可為抗病育種的研究提供豐富的樣本。本研究篩選出的CENPA的內(nèi)含子具有豐富的多態(tài)性，而外顯子上的SNPs位點(diǎn)是否與抗病有關(guān)，CENPA基因具體怎么對(duì)抗病性產(chǎn)生影響，還有待進(jìn)一步研究。