楊玲玲， 劉凡值， 孟慶楊， 申 剛

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶作物研究所， 貴州 興義 562400；2.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽(yáng) 550006)

薏苡(Coixlacryma-jobiL.)是重要的藥食同源經(jīng)濟(jì)作物，既是營(yíng)養(yǎng)成分豐富的小雜糧，又是藥效廣泛的中藥材，整個(gè)植株均含有多種功能活性成分，包括油脂、多酚、類(lèi)黃酮、多糖、維生素及礦物元素等。薏苡具有多種保健功能，但是，目前生產(chǎn)用種相對(duì)單一，單產(chǎn)不高，綜合性狀差，優(yōu)質(zhì)薏苡新品種缺乏，嚴(yán)重制約了薏苡生產(chǎn)的發(fā)展，亟需大力開(kāi)展薏苡的遺傳育種研究，以推進(jìn)薏苡種植業(yè)的良好發(fā)展[1-2]。

人工誘變育種是通過(guò)利用物理、化學(xué)等因素來(lái)誘發(fā)作物產(chǎn)生所需性狀的育種方法。該育種方法能夠有效解決種質(zhì)資源匱乏的問(wèn)題，且操作簡(jiǎn)單、成本較低、大小規(guī)模均可運(yùn)用[3]。60Co-γ射線(xiàn)和EMS是實(shí)踐中常用的兩種誘變劑，其中60Co-γ射線(xiàn)是一種相較于其他輻射源(X射線(xiàn)、β射線(xiàn)、激光、中子、紫外線(xiàn)、離子束等)更具能量及穿透性的電磁輻射形式[4-7]，能破壞或改變作物細(xì)胞的重要成分，且不同輻射劑量對(duì)作物在形態(tài)、生理生化等方面產(chǎn)生不同的影響；EMS能通過(guò)核苷酸取代，特別是通過(guò)鳥(niǎo)嘌呤烷基化，讓作物遺傳物質(zhì)產(chǎn)生隨機(jī)突變[8-9]，因此，60Co-γ射線(xiàn)誘變和EMS誘變被廣泛地應(yīng)用到作物新品種育種中，例如水稻[10]、小麥[11]、高粱[12]、大豆[13]、甘蔗[14]等。相關(guān)研究顯示，誘變劑處理作物時(shí)，劑量的變化可以調(diào)節(jié)突變的頻率及飽和度，則對(duì)作物產(chǎn)生不同影響，并且不同誘變劑對(duì)同種作物產(chǎn)生的影響也不同，John等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在相關(guān)作物中EMS誘變比物理誘變劑更有效。因此，探究適合的誘變劑及適宜的劑量(特別是半致死劑量)對(duì)高效、合理地開(kāi)展人工誘變育種工作具有重大意義。

目前，在薏苡人工誘導(dǎo)育種工作中，利用輻射誘變進(jìn)行新種質(zhì)創(chuàng)制的研究還比較少，如沈曉霞等[16]、劉鵬飛等[17]分別初步探討了γ射線(xiàn)對(duì)薏苡種子的誘變作用，但利用EMS等化學(xué)誘變劑處理薏苡的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究分別探討了60Co-γ射線(xiàn)和EMS對(duì)薏苡CDT及Y 159的誘變作用，旨在篩選60Co-γ輻照和EMS誘變薏苡種子的最適劑量(濃度)，為薏苡相關(guān)育種工作提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗(yàn)材料為泰國(guó)栽培型薏苡CDT、中國(guó)云南野生薏苡Y 159。

1.2 方 法

將每種材料的2 100粒去殼種子平均分成7袋。分別用7個(gè)劑量(150、250、350、450、550、650、750 Gy)的60Co-γ射線(xiàn)對(duì)種子進(jìn)行輻照處理，未經(jīng)輻照處理(0 Gy)的種子作為對(duì)照(ck)。將去殼的薏苡Y 159種子分成13袋(每袋100粒)，分別放入不同濃度(0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%、3.2%、3.6%、4.0%、4.4%、4.8%、5.2%)EMS處理液中浸泡10 h，未經(jīng)EMS處理的為對(duì)照組，每個(gè)處理重復(fù)3次。10 h后，從EMS處理液中取出種子，用無(wú)菌蒸餾水沖洗5次，以避免過(guò)度處理和EMS的殘留。

將處理組及對(duì)照組種子分別種植在盛有泥炭蘚的育苗盤(pán)中，種子深度為1 cm。將育苗盤(pán)置于溫度為26 ℃、相對(duì)濕度為80%的溫室中，每2天澆水一次。進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，從播種后第12天開(kāi)始，按公式計(jì)算每批種子的發(fā)芽率。

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù))×100%，

根據(jù)發(fā)芽率計(jì)算半致死劑量。

苗長(zhǎng)出3～4片葉片(播種后25 d)后測(cè)量幼苗株高(測(cè)苗基部至根尖的長(zhǎng)度)。根據(jù)對(duì)照植株的特性計(jì)算突變率。

突變率(%)=(突變株數(shù)/總株數(shù))×100%。

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同60Co-γ劑量輻照對(duì)薏苡種子萌發(fā)的影響

薏苡種子在播種后的第4天開(kāi)始萌發(fā)，第12天萌發(fā)結(jié)束。觀察結(jié)果顯示，隨著輻射劑量的增加，2個(gè)薏苡品種(CDT和Y 159)種子萌發(fā)均發(fā)生延遲，且當(dāng)輻照劑量超過(guò)350 Gy時(shí)延遲效果明顯；低劑量輻射能提高薏苡種子(CDT和Y 159)的發(fā)芽率，第4天和第5天，150 Gy和250 Gy輻照種子的發(fā)芽率顯著高于對(duì)照，且不同品種的發(fā)芽率不同(表1)。

表1 不同60Co-γ劑量輻照對(duì)播種后4、5、6、8、12 d薏苡種子發(fā)芽率的影響

分析可知，所有劑量的輻照對(duì)薏苡種子萌發(fā)均有顯著影響，隨著輻照劑量的增加，發(fā)芽率逐漸降低，并且輻照劑量對(duì)薏苡種子萌發(fā)的影響因品種而異，其中對(duì)薏苡Y 159種子萌發(fā)的影響較為明顯。具體來(lái)看，對(duì)于薏苡Y 159，0 Gy輻照處理和150 Gy輻照處理的發(fā)芽率均顯著高于其他處理組種子的發(fā)芽率，且當(dāng)輻照劑量超過(guò)450 Gy時(shí)，幾乎所有種子都不能萌發(fā)；對(duì)于薏苡CDT，0 Gy輻照處理和250 Gy輻照處理的發(fā)芽率均顯著高于其他處理組種子的發(fā)芽率，且輻照對(duì)薏苡CDT種子萌發(fā)的影響較小，當(dāng)輻照劑量達(dá)到750 Gy時(shí)仍有10.7%的種子發(fā)芽。因此，根據(jù)以上測(cè)量的不同60Co-γ劑量輻照下的種子發(fā)芽率，初步可知150～450 Gy的輻照劑量適合薏苡CDT和Y 159(表2)。

表2 不同60Co-γ劑量輻照下薏苡CDT和Y 159種子的發(fā)芽率

2.2 不同60Co-γ劑量輻照對(duì)薏苡幼苗生長(zhǎng)的影響

在播后25 d時(shí)，對(duì)薏苡植株的突變率和株高進(jìn)行了測(cè)定，其中植株突變的判斷標(biāo)準(zhǔn)是輻照植株與對(duì)照植株(0 Gy)表現(xiàn)出不同的葉形時(shí)，則為突變體。結(jié)果(表3)顯示，薏苡CDT和Y 159植株的突變率隨輻照劑量的增加而增加，低劑量輻照對(duì)植株突變率影響不大，但從250 Gy開(kāi)始，隨著輻照劑量的增加，突變率急劇增加，在450 Gy時(shí)突變率幾乎達(dá)到100%。輻照劑量對(duì)薏苡幼苗生長(zhǎng)速率也有顯著影響，隨著輻照劑量的增加，幼苗株高逐漸降低，進(jìn)一步分析可知，150 Gy以上的輻照顯著抑制薏苡幼苗生長(zhǎng)，且呈劑量依賴(lài)性，而輻照劑量達(dá)到450 Gy及以上，幼苗停止生長(zhǎng)。因此，由上可推斷輻照劑量對(duì)2個(gè)薏苡品種的幼苗生長(zhǎng)均有顯著影響。

表3 不同60Co-γ劑量輻照下薏苡植株突變率及株高

2.3 EMS處理對(duì)薏苡種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

由表4可知，不同濃度EMS誘變劑對(duì)薏苡Y 159的種子發(fā)芽率和幼苗的突變率、株高有顯著影響。結(jié)果顯示，隨著EMS濃度的增加，種子發(fā)芽率逐漸降低，且當(dāng)濃度低于1.2%時(shí)，發(fā)芽率受影響程度不大，高于1.2%時(shí)，發(fā)芽率明顯受影響，而當(dāng)濃度大于4.4%時(shí)，Y 159種子的發(fā)芽率接近于零；EMS濃度對(duì)幼苗突變率也有很大影響，雖然低濃度EMS對(duì)突變率無(wú)顯著影響，但當(dāng)濃度高于1.2%時(shí)，隨著濃度的增加，突變率逐漸顯著增加，且當(dāng)濃度高于4.0%時(shí)Y 159植株的突變率達(dá)100%；另外，幼苗的生長(zhǎng)對(duì)EMS也很敏感，當(dāng)EMS濃度大于0.4%時(shí)，生長(zhǎng)速率受到影響，當(dāng)濃度超過(guò)1.2%時(shí)，生長(zhǎng)速率顯著下降，而這種抑制作用在2.0%、2.4%、3.2%、3.6%和4.0%時(shí)略有減輕，表明EMS對(duì)幼苗株高的影響并不是完全由EMS濃度決定的。

表4 EMS處理對(duì)薏苡Y 159的種子發(fā)芽率和幼苗突變率、株高的影響

2.4 60Co-γ輻照和EMS誘變下薏苡半致死劑量的研究

根據(jù)種子發(fā)芽率[18]，利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0確定半致死劑量(LD50)。結(jié)果表明，60Co-γ輻照處理下，薏苡CDT和Y 159的回歸方程各為L(zhǎng)D50=2.222-0.005X和LD50=2.053-0.007X(X=種子發(fā)芽率)，則計(jì)算出薏苡CDT和Y 159的半致死劑量分別為406.305 Gy和284.795 Gy；EMS誘變處理下，薏苡Y 159的回歸方程為L(zhǎng)D50=1.807-0.737X，X為種子發(fā)芽率，計(jì)算出薏苡Y 159的半致死劑量為2.453%。

3 結(jié)論與討論

人工誘變方法能夠在任何作物中短時(shí)間內(nèi)高效獲取大量無(wú)序的突變后代，是一種獲得育種資源的有效途徑。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)誘變處理后，薏苡種子的萌發(fā)受到了明顯的抑制，萌發(fā)時(shí)間延遲，且隨著誘變劑濃度(劑量)的增加，種子的發(fā)芽率呈逐漸下降的趨勢(shì)，與Datir等[19]在木豆中的研究結(jié)果相一致，Kumar[20]研究發(fā)現(xiàn)，黃秋葵的發(fā)芽率通常隨著γ射線(xiàn)劑量和EMS濃度的增加而降低；松屬植物[21]、鷹嘴豆[20]等的發(fā)芽率也隨著γ輻照劑量的增加而降低。相關(guān)研究表明，在誘變劑處理下，種子發(fā)芽率降低可能是由誘變劑對(duì)種子分生組織產(chǎn)生影響而導(dǎo)致的[22]，由此推測(cè)在高劑量60Co-γ和高濃度EMS誘變下，薏苡種子發(fā)芽率變低可能是由于這兩種誘變劑分別對(duì)薏苡種子在細(xì)胞水平上產(chǎn)生了物理或生理水平的干擾。

本試驗(yàn)中出現(xiàn)的薏苡種子發(fā)芽率、幼苗突變率依賴(lài)誘變劑劑量變化而變化以及不同誘變劑對(duì)不同品種的薏苡產(chǎn)生的影響不同的現(xiàn)象，表明選擇合適的誘變劑及劑量是實(shí)踐中薏苡誘變育種成功的關(guān)鍵。在利用物理或化學(xué)誘變劑對(duì)相關(guān)作物進(jìn)行人工誘變時(shí)，半致死劑量被認(rèn)為是用來(lái)處理原始材料的最佳劑量[18]。經(jīng)計(jì)算可知，在60Co-γ輻照處理下，薏苡CDT和Y 159的半致死劑量分別為406.305 Gy和284.795 Gy，在EMS誘變處理下，薏苡Y 159的半致死劑量為2.453%，由此可以進(jìn)一步推測(cè)，相較于薏苡CDT，Y 159對(duì)60Co-γ輻照更敏感，且對(duì)于同種作物不同品種的誘變?cè)疾牧?，其適宜的誘變劑處理濃度不相同。

本研究結(jié)果表明，利用不同誘變劑以及同種誘變劑不同處理濃度(劑量)進(jìn)行誘變處理時(shí)，薏苡CDT和Y 159幼苗發(fā)生顯著突變，主要表現(xiàn)為葉型變異以及株高顯著降低，這與沈曉霞等[16]的研究結(jié)果相一致。其中薏苡Y 159作為野生薏苡，具有品質(zhì)優(yōu)、抗性好、產(chǎn)量高和多年生等優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)異的育種原始材料，但與其他野生薏苡資源一樣，Y 159植株高度過(guò)高，不抗倒伏，而本研究60Co-γ輻照和EMS處理能降低薏苡幼苗株高，有望為以后在薏苡種質(zhì)創(chuàng)新中更好地利用野生薏苡資源提供參考。