鐘 磊， 錢家萍， 蔡啟忠， 王 敏， 張慧曄， 楊 全， 羅 碧

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院， 廣州 510006；2.國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點(diǎn)研究室，國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣州綜合試驗(yàn)站，廣東省南藥規(guī)范化種植與綜合開發(fā)工程技術(shù)研究中心， 廣州 510006；3.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司， 廣州 510006)

肉桂(CinnamomumcassiaPresl)又名桂，為樟科樟屬常綠喬木，主產(chǎn)于廣東、廣西、云南等地區(qū)，干燥樹皮(桂皮)、小枝(桂枝)、果實(shí)(桂子)均可入藥[1]，桂皮具有補(bǔ)火助陽，引火歸元，散寒止痛，溫通經(jīng)脈的功效[2]。肉桂的繁殖方式有種子繁殖、萌蘗繁殖和扦插繁殖，其中種子繁殖得到的肉桂幼苗根系發(fā)達(dá)、生命力頑強(qiáng)。肉桂種子屬于頑拗性種子[3]，具有脫水敏感性，即種子含水量低于某個(gè)臨界點(diǎn)時(shí)，種子活力會(huì)迅速喪失，保存難度大，只能隨采隨播[4]，因此對(duì)肉桂種子研究較少。大田育苗為傳統(tǒng)的肉桂育種方式，但發(fā)芽率并不高。前人對(duì)肉桂種子催芽方式進(jìn)行了研究，彭壽強(qiáng)等[5]研究發(fā)現(xiàn)，水洗催芽的肉桂種子發(fā)芽率顯著高于沙藏催芽。李開祥等[6]發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度GA3浸泡后的肉桂種子發(fā)芽率明顯高于對(duì)照，且在18～20 d發(fā)芽率最高，達(dá)到90%。

隨著肉桂產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，人工栽培面積的不斷擴(kuò)大[7]，肉桂種子成為了種苗繁育最基本最重要的生產(chǎn)資料，而通過發(fā)芽率評(píng)價(jià)肉桂種子的質(zhì)量存在時(shí)間長、檢驗(yàn)難度大的問題。種子生活力測定能快速鑒定種子發(fā)芽能力，預(yù)測種子在發(fā)芽和出苗時(shí)的活力，是種子質(zhì)量檢測的重要方式之一。雷慧霞等[8]通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了TTC法快速測定白鮮種子的最佳條件。馬洪娜等[9]通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化了TTC法測定山豆根根種子生活力條件，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)結(jié)果一致。目前對(duì)肉桂種子的貯藏方式、苗木繁育、栽培方法等方面有所研究，但未見對(duì)肉桂種子生物學(xué)特性及生活力測定研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)肉桂種子形態(tài)特征、千粒重、含水量、萌發(fā)特性、生活力測定等方面進(jìn)行研究，以期找到較高發(fā)芽率的種子萌發(fā)方法及最佳的生活力測定條件，為肉桂種子質(zhì)量控制和種苗繁育技術(shù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2019年3月至4月，采集廣東云浮市羅定市榃濱鎮(zhèn)(22°48′43″N，111°24′16″E)三十生肉桂母樹的成熟肉桂種子作為試驗(yàn)材料，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為肉桂(CinnamomumcassiaPresl.)植物種子。

1.2 方 法

1.2.1外觀形態(tài)觀察

將采摘回來的肉桂種子去掉果皮，觀察并描述種子的顏色、形狀、質(zhì)地等外觀形態(tài)。隨機(jī)取30粒種子，用游標(biāo)卡尺(精密度0.01 mm)測量肉桂種子長度和直徑，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2千粒重和含水量的測定

根據(jù)(GB/T 3543.7-1995)《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程》[10]，采用千粒重法測定肉桂種子的千粒重。根據(jù)(GB 2772-1999)《林木種子檢驗(yàn)規(guī)程》[11]測定肉桂種子含水量。

1.2.3不同萌發(fā)方式對(duì)肉桂種子發(fā)芽率的影響

設(shè)計(jì)4個(gè)萌發(fā)方式處理，分別為培養(yǎng)皿萌發(fā)、水洗催芽法、濕沙萌發(fā)、干沙萌發(fā)，每隔5 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.4種子生活力測定的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)《國際種子檢驗(yàn)規(guī)程》[12]，采用三苯基氯化四氮唑(TTC)法測定肉桂種子生活力。為確定肉桂種子生活力測定的最佳條件，本實(shí)驗(yàn)采用三因素三水平的正交試驗(yàn)L9(33)設(shè)計(jì)法比較TTC濃度、染色溫度和染色時(shí)間等因素對(duì)種子生活力的影響(表1)。

表1 TTC測定因素和測定水平

1.2.5種子的預(yù)處理和生活力判斷

取50粒肉桂種子，用蒸餾水浸泡6 h，使種子充分吸水，用濾紙吸干表面的水分，并沿種子長軸縱向切開成兩半，使其胚露出，然后將種子置于裝有TTC溶液的棕色瓶中，放置在已設(shè)定好溫度的水浴箱中染色。每個(gè)處理重復(fù)3次。

肉桂種子生活力的判斷標(biāo)準(zhǔn)參照《國際種子檢驗(yàn)規(guī)程》[12]，胚的主要組織染成粉紅色或紅色即為有活力的種子，按以下公式計(jì)算種子生活力：

種子生活力(%)=(染色數(shù)目/種子數(shù)目)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016軟件、SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)特征

成熟的肉桂種子呈紫黑色，卵形至長卵形，種皮堅(jiān)硬，表面光滑且具有蠟質(zhì)光澤，種柄延伸方向有8～13條突起的棱；種子長度為7.91～12.78 mm，直徑為6.34～7.67 mm。肉桂種子千粒重平均值為262.41 g，標(biāo)準(zhǔn)差為1.73，變異系數(shù)(CV)為0.007；種子含水率平均值為35.99%，標(biāo)準(zhǔn)差為2.67，變異系數(shù)為0.074(表2)。

表2 肉桂種子千粒重及含水量

2.2 不同萌發(fā)方式對(duì)肉桂種子發(fā)芽率的影響

不同萌發(fā)方式對(duì)肉桂種子發(fā)芽率的影響如圖1所示，培養(yǎng)皿萌發(fā)、水洗催芽和濕沙萌發(fā)這3種萌發(fā)方式的大部分肉桂種子均在前15 d發(fā)芽，其中在濕沙條件下發(fā)芽率最高，為76.67%，培養(yǎng)皿萌發(fā)和水洗催芽條件下的萌發(fā)率分別為68.67%和51.2%，干沙條件下的肉桂種子幾乎不發(fā)芽。

2.3 肉桂種子生活力測定結(jié)果

由表3可見，肉桂種子生活力最高為98.67%，對(duì)應(yīng)的染色條件為TTC濃度為1%、染色溫度為35 ℃、染色時(shí)間為8 h，此條件下大部分肉桂種子的胚或胚根均被染成紅色或粉紅色；種子生活力最低為23.33%，對(duì)應(yīng)的染色條件為0.1%、染色溫度為25 ℃、染色時(shí)間為4 h，此條件下肉桂種子胚或胚根大部分未被染色。

2.4 極差分析

由表3可見，TTC濃度的極差值最大，R=48.889，染色時(shí)間的極差最小，R=13.333。因此影響肉桂種子生活力的因素主次為TTC濃度>染色溫度>染色時(shí)間，即在染色時(shí)TTC濃度和染色溫度為主要影響因素，而染色時(shí)間對(duì)其影響相對(duì)較小。

表3 正交實(shí)驗(yàn)TTC法測定肉桂種子生活力

2.5 方差分析

進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(表4)，可以看出，試驗(yàn)中3個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果都具有極顯著差異(p<0.01)，說明TTC濃度和染色溫度是肉桂種子活力測定的重要因素。

比較各因素不同水平下肉桂種子生活力平均值(表5)，TTC濃度、染色溫度和染色時(shí)間在第3水平下的平均種子生活力是最大的，分別為85.78%、79.11%和73.78%。且各因素下不同水平之間的平均種子生活力差異顯著(p<0.05)。因此肉桂種子生活力測定條件初步認(rèn)為TTC濃度為1%，染色溫度為35 ℃，染色時(shí)間為12 h。

表5 各因素不同水平肉桂種子生活力平均值比較

2.6 肉桂種子生活力測定適宜條件驗(yàn)證

對(duì)正交試驗(yàn)中未出現(xiàn)TTC濃度為1%、染色溫度為35 ℃、染色時(shí)間為12 h的試驗(yàn)組進(jìn)行染色條件驗(yàn)證，結(jié)果如表6所示。種子平均生活力為96.67%，較方差實(shí)驗(yàn)的第9組低，且染色時(shí)間較長。因此肉桂種子生活力測定條件為TTC濃度為1%、染色溫度為35 ℃、染色時(shí)間為8 h。

表6 肉桂種子生活力的驗(yàn)證

3 結(jié)果與討論

3.1 種子形態(tài)特征和萌發(fā)特性

肉桂成熟種子呈紫黑色，卵形或長卵形，種皮堅(jiān)硬，種柄延伸方向有8～13條突起的棱；種子長7.91～12.78 mm，直徑6.34～7.67 mm，千粒重平均值為262.41 g，種子含水量平均值為35.99%。肉桂種子成熟時(shí)，種皮的顏色由紫黑色轉(zhuǎn)為黑褐色，萌發(fā)時(shí)種子頂端稍微裂開，胚根露出。本研究結(jié)果表明，不同萌發(fā)環(huán)境對(duì)肉桂種子萌發(fā)率有很大的影響，發(fā)芽率順序?yàn)闈裆趁劝l(fā)>培養(yǎng)皿萌發(fā)>水洗催芽>干沙萌發(fā)。田云等[13]發(fā)現(xiàn)，姜黃種子在濕沙條件下的萌發(fā)效果較濾紙培養(yǎng)皿。本研究結(jié)果與之一致，說明濕沙能較好保持種子的含水量，有利于種子萌發(fā)。而通過水洗催芽技術(shù)發(fā)現(xiàn)，肉桂種子的萌發(fā)效果比較差，在操作過程中發(fā)現(xiàn)種子表面極易霉變且種皮易破，這與彭壽強(qiáng)等[5]研究結(jié)果不一致，原因可能是在陰涼通風(fēng)處放置時(shí)種子表面的水分容易蒸發(fā)，且與發(fā)芽床中溫度相比，較大的室溫變化會(huì)影響種子的萌發(fā)。

3.2 TTC法測定肉桂種子生活力的最佳條件

種子質(zhì)量是藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的重要基礎(chǔ)和前提，而種子發(fā)芽率是檢測種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[14]。通過種子發(fā)芽率來判斷肉桂種子的質(zhì)量過程較長，許勇等[15]研究表明，肉桂種子播種后至少需要30 d基本發(fā)芽；李開祥等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在GA3浸種下的肉桂種子萌發(fā)率雖然得到了顯著的提高，并縮短發(fā)芽時(shí)間。TTC法檢測種子生活力是一種能快速判斷種子萌發(fā)潛力和質(zhì)量的有效方法，現(xiàn)已在多種藥用植物種子質(zhì)量檢測中廣泛運(yùn)用[16]，但不同植物種子的TTC法最佳測定條件不同，如明孟碟等[17]采用TTC染色法測定天師栗種子生活力的最佳條件為0.2%TTC溶液避光染色11～13 h，劉雅嵐等[18]通過TTC染色法分別確定了欖仁樹、水黃皮、銀合歡、見血封喉、黃槿等5種熱帶林木的種子生活力，結(jié)果表明，各種種子的染色溫度、染色時(shí)間和TTC濃度均不相同。本試驗(yàn)中，正交設(shè)計(jì)組合9中的肉桂種子生活力達(dá)到98.67%，為正交試驗(yàn)中最佳的染色條件，即肉桂種子在35 ℃條件下浸泡在1% TTC溶液避光染色8 h。雖然通過數(shù)據(jù)方差分析初定肉桂種子在35 ℃條件下1%的TTC溶液避光染色12 h為較優(yōu)方案，但是該方案與組合9比較，染色時(shí)間較長，且染色效果不及組合9。極差分析表明，TTC濃度和染色溫度是影響肉桂種子生活力的較重要的因素，而染色時(shí)間對(duì)生活力的測定影響較小，因此處理9可以作為最優(yōu)組合。綜上所述，肉桂種子生活力測定的最佳條件為TTC濃度為1%、染色溫度為35 ℃、染色時(shí)間為8 h。

3.3 TTC法測定肉桂種子生活力的可行性

相關(guān)研究表明，通過TTC法測定種子生活力的結(jié)果一般大于或等于發(fā)芽率。羅光明等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TTC染色法測定的車前子種子生活力與發(fā)芽率呈顯著的正相關(guān)。鐘淑梅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)活種子生活力顯著高于發(fā)芽率，且兩者之間呈極顯著相關(guān)性；彭云霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，小葉黑柴胡種子生活力和發(fā)芽率具有明顯的線性關(guān)系。本研究中肉桂種子生活力最高為98.67%，發(fā)芽率為76.67%，種子的生活力高于發(fā)芽率，這可能是因?yàn)榉N皮含有萌發(fā)抑制物導(dǎo)致了種子休眠。杜會(huì)聰?shù)萚22]研究表明，臘梅種子的種仁和種皮中的萌發(fā)抑制物能顯著抑制白菜種子的萌發(fā)及芽和根的生長。李詢等[23]研究表明，多花黃精種子種皮中含有較多的萌發(fā)抑制物，具有抑制種子萌發(fā)和幼苗生長的作用。同時(shí)因?yàn)槿夤鸱N子含多油性物質(zhì)且易失活的特點(diǎn)，因此萌發(fā)環(huán)境對(duì)種子的發(fā)芽率影響也很大。本研究通過TTC法測定肉桂種子生活力需要8 h，而通過萌發(fā)實(shí)驗(yàn)測定肉桂種子發(fā)芽率則需要至少15 d。因此在實(shí)際生產(chǎn)中可先采用TTC法測定肉桂種子的生活力來判斷肉桂種子潛在的發(fā)芽能力并了解種子的質(zhì)量。