焦 寒 徐 陽 范冰凌 林欣欣 付杰軍

胎盤發(fā)育和功能障礙可導致子癇前期、胎兒生長受限、復發(fā)流產(chǎn)等妊娠相關疾病[1,2]。3M綜合征(OMIM#273750)是一種罕見的以嚴重宮內(nèi)發(fā)育遲緩和出生后生長遲緩為主要特征的一種常染色體隱性遺傳病[3]。目前已報道的3M綜合征的突變基因是定位在常染色體p21.1上的Cul7基因，含有26個外顯子，編碼1698個氨基酸[4]。泛素連接酶Cul7基因敲除小鼠的主要表型是胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩，胎盤發(fā)育和結(jié)構(gòu)異常[5]。已報道3M綜合征患者Cul7基因存在40多個不同位點的錯義突變或無義突變[6]。近年來還發(fā)現(xiàn)3M綜合征患者有常染色體2q35～36.1上的OBSL1(ob-scurin-like 1)基因突變和19q13.2～q13.32上的CCDC8(coiled-coil domain-containing protein 8)基因突變[7,8]。而Cul7是主要致病基因，已報道3M綜合征中67%有Cul7基因突變，28%是OBSL1基因突變，5%是CCDC8突變。3M突變基因可以形成3M復合體(FBXW8-Cul7-OBSL1-CCDC8)調(diào)控基因組穩(wěn)定性[6]。然而，Cul7對小鼠和人胎盤發(fā)育的調(diào)控機制還不清楚。

Notch信號通路與胚胎發(fā)育和成人器官組織穩(wěn)態(tài)密切相關，尤其對于上皮干細胞和細胞分化起重要作用[9]。Notch受體是單一跨膜蛋白，由功能性胞外(NECD)、跨膜(TM)和胞內(nèi)(NICD)結(jié)構(gòu)域組成，NICD為Notch受體的活化形式[10]。哺乳動物有4種Notch受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)。在妊娠早期，Notch1主要表達在增殖活躍的近端滋養(yǎng)層柱細胞，并在絨毛外滋養(yǎng)層細胞(EVT)形成過程中表達迅速降低，在妊娠12周的胎盤絨毛滋養(yǎng)層細胞滋養(yǎng)層柱幾乎檢測不到Notch1的表達[11]。Notch1抑制滋養(yǎng)層細胞的侵襲和遷移，在滋養(yǎng)層細胞自發(fā)融合過程中維持E-cadherin的表達，抑制人絨毛膜促性腺激素β(hCGβ)表達及滋養(yǎng)層細胞融合[9]。筆者前期報道了Cul7在細胞滋養(yǎng)層柱高表達，過表達Cul7能引起絨毛癌細胞JEG3上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)類似的變化[5]。本研究通過探索Cul7對Notch1蛋白穩(wěn)定性的影響，揭示Cul7在胎盤發(fā)育中的可能調(diào)控作用。

材料與方法

1.細胞株：小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)由美國哈佛醫(yī)學院貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心病理系魏文毅教授惠贈。人絨毛外滋養(yǎng)層細胞HTR8/SVneo由中國科學院動物研究所干細胞與生殖生物學國家重點實驗室王紅梅研究員惠贈。

2.主要試劑：胎牛血清購自維森特生物技術(南京)有限公司，RPMI1640高糖培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、opti-MEM減血清培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；青霉素鏈霉素混合液100×購自北京索萊寶科技有限公司；慢病毒干擾載體PGLV3/H1/GFP+Puro穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G，慢病毒包裝系統(tǒng)干擾Cul7表達及空載病毒液購自上海吉瑪制藥技術有限公司；BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，RIPA buffer購自美國Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINE3000、TRIzol Reagent、PierceTMPhosphatase Inhibitor Mini Tablets和PierceTMProtase Inhibitor Mini Tablets、EDTA-free購自美國Invitrogen公司；High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒、anti-HA Magnetic Beads購自美國Thermo公司。

3.抗體：兔抗人Notch1(3439)、兔抗人Notch3(5276)、鼠抗人Myc(2276)、兔抗人Jagged1(2620)、兔抗人IRS-1(3407)、兔抗人survivin(5875)、兔抗人β-catenin(8480)、兔抗人HES1(11988)、兔抗人cyclinD3(2936)、兔抗人P21(2947)、兔抗人Notch4(2423)、兔抗人β-tubulin(2128)、鼠抗人β-actin(3700)、鼠抗人HA(2367)和羊抗鼠IgG(7076)、羊抗兔IgG(7074)購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人Cul7(C1743)、兔抗人Flag(SAB4301135)購自美國Sigma公司；鼠抗人TRIM24(ab70560)購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

4.細胞培養(yǎng)：HTR8/SVneo細胞培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基；MEF細胞和293T細胞培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，細胞在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

5.質(zhì)粒構(gòu)建：根據(jù)pNL-IRES2-EGFP-NICD1的功能編碼區(qū)序列和載體p3×FLAG-CMV-10序列特點,選擇EcoRⅠ和BamHⅠ作為雙酶切位點，設計PCR擴增引物序列，Notch1上游引物：5′-CGAATTCAGTGCTGCTGTCCCGCAAGCGCCGGCG-3′，下游引物：5′-TAGCGGATCCTCACTTGAAGGCCTCCGGAATGCGGGCGATC-3′。通過PCR法擴增目的序列，采用1%的瓊脂糖凝膠對PCR最終產(chǎn)物電泳，在紫外線燈下切取含目的片段的凝膠，回收并純化目的片段。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α，選取7個單克隆菌落，取少量行PCR鑒定，取陽性克隆的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒，送上海生工生物工程公司測序。HA-Cul7全長及不同長短的質(zhì)粒、各Cullin蛋白家族成員Myc-Cul1、Myc-Cul2、Myc-Cul3、Myc-Cul4A、Myc-Cul4B、Myc-Cul5、Myc-Cul7質(zhì)粒及HA-FBXW7質(zhì)粒由美國哈佛醫(yī)學院貝斯以色列女執(zhí)事醫(yī)療中心病理系魏文毅教授惠贈。

6.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期細胞接種到60mm培養(yǎng)皿中，待皿中細胞生長到90%以上匯合度時，按照LipofectAMINE 3000操作說明書進行轉(zhuǎn)染。將10μl P3000TM加入300μl opti-MEM中混勻，將DNA預混液加入稀釋的P3000TM孵育15min形成DNA-脂質(zhì)體復合物，均勻滴入培養(yǎng)皿后在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48h收集蛋白。

7.慢病毒介導shRNA干擾HTR8/SVneo細胞Cul7的表達：構(gòu)建慢病毒載體shRNA序列為：Cul7shRNA 5′-GCACATGTTGAGTAGTCCTGATTAT-3′和Cul7shRNA 5′-ATAATCAGGACTACTCAACATGTGC-3′，同時構(gòu)建陰性對照shRNA序列為5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。將上海吉瑪生物有限公司構(gòu)建的慢病毒表達載體shCul7和PGLV3/H1/GFP+Puro穿梭質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G導入293T細胞中培養(yǎng)48h和72h后收集上清進行病毒液濃縮并檢測病毒的滴度達到1×109TU/ml。嘌呤霉素篩選穩(wěn)定敲低Cul7的HTR8/SVneo細胞。

8.real-time PCR檢測目的基因mRNA的表達：使用Trizol提取細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。根據(jù)PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑盒說明操作，引物序列如表1所示，總反應體系為25μl，反應條件為 50℃ 2min； 95℃預變性 2min，95℃變性 15s、60℃ 1min，40個循環(huán)。

表1 引物序列

8.Western blot法檢測目的基因蛋白的表達：使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量法測蛋白濃度，蛋白裂解液與上樣緩沖液按2∶1混合煮沸5min，上樣50μg，進行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1.5h后加入1∶1000稀釋的一抗4℃孵育過夜，用TBST洗滌后加入1∶5000稀釋的二抗室溫孵育1h。TBST洗膜，加入ECL發(fā)光試劑利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯示結(jié)果。

9.免疫共沉淀檢測蛋白相互作用情況：將Flag-Notch1重組質(zhì)粒、HA-Cul7真核表達質(zhì)粒和HA-FBXW7真核表達質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導入HTR8/SVneo細胞，48h后使用溫和蛋白裂解液裂解細胞，測定蛋白濃度，取1mg蛋白進行免疫共沉淀實驗。將蛋白樣品加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液至500μl，并加入20μl anti-HA Magnetic Beads磁珠，在4℃旋轉(zhuǎn)孵育4h，形成免疫復合物。用NETN緩沖液將磁珠洗滌3次，棄去緩沖液并加入50μl 2×SDS上樣緩沖液，搖勻煮沸5min后7500r/min離心2min，將上清移入新試管中用于免疫印跡分析。免疫沉淀檢測使用1∶1000稀釋的兔抗人Flag和鼠抗人HA。

結(jié) 果

1.Notch1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定：將含有人Notch1胞內(nèi)段基因的重組質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-Notch1送上海生工生物工程公司進行測序鑒定，將得到的測序結(jié)果在NCBI提供的數(shù)據(jù)庫進行序列比對，結(jié)果與預期一致，表明已克隆人全長Notch1基因，并成功構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒p3×FLAG-CMV-Notch1(圖1中A、B)。將HA-Cul7全長及不同長截短片段的質(zhì)粒、各Cullin蛋白家族成員Myc-Cul1、Myc-Cul2、Myc-Cul3、Myc-Cul4A、Myc-Cul4B、Myc-Cul5、Myc-Cul7及Flag-Notch1(NICD)真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HTR8/SVneo后收集細胞蛋白，Western blot法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染效率顯著(圖1中C、D)。

圖1 p3×FLAG-CMV-Notch1質(zhì)粒構(gòu)建及測序鑒定A.質(zhì)粒圖譜；B.重組質(zhì)粒測序圖(部分)；C. 轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-Cul7全長及Cul7不同長短的截短質(zhì)粒；D.轉(zhuǎn)染各Cullin蛋白家族成員質(zhì)粒

2.Cul7基因敲除小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)Notch1蛋白表達升高：首先在MEF細胞中確定Cul7對Notch1的調(diào)控作用。Western blot法檢測野生型MEF細胞和Cul7基因敲除MEF細胞中Notch受體Notch1、Notch3、Notch4及配體Jagged1的蛋白表達，結(jié)果顯示敲除Cul7后Notch1蛋白(圖2)及其下游靶基因HES1和P21蛋白表達增加。

圖2 Cul7基因敲除MEF細胞Notch1蛋白表達升高A.Notch1、HES1及P21蛋白表達增加；B.Notch1、Notch3及Notch4蛋白表達增加

3.Cul7負調(diào)控細胞滋養(yǎng)層細胞Notch1蛋白表達：使用Western blot法檢測干擾及過表達Cul7的HTR8/SVneo細胞Notch1及其下游靶基因的蛋白表達。結(jié)果顯示Cul7干擾效率顯著，干擾Cul7后Notch1蛋白表達升高，其主要下游靶基因HES1和P21蛋白水平同樣升高(圖3A)，而過表達Cul7使Notch1蛋白表達降低(圖3中B、C)。通過real-time PCR方法進一步確定Cul7是否在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控Notch1表達。結(jié)果顯示，與對照組比較，干擾Cul7的HTR8/SVneo細胞Notch1 mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義(P=0.129，圖3D)。

圖3 Cul7抑制HTR8/SVneo細胞Notch1蛋白的表達A.干擾Cul7后Notch1蛋白表達；B、C.過表達Cul7后Notch1蛋白表達；D.干擾Cul7后Notch1 mRNA的表達水平

4.Cul7對Notch1蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控：通過使用蛋白酶體抑制劑MG132確定HTR8/SVneo細胞Notch1蛋白的泛素-蛋白酶體通路介導降解。不同濃度的MG132(0、0.1、0.5、1、2、4μmol/L)處理HTR8/SVneo細胞12h后收集蛋白，Western blot法檢測結(jié)果顯示，Notch1蛋白水平隨MG132濃度增加而升高(圖4A)。為了確定Cul7對Notch1蛋白的調(diào)控作用，將穩(wěn)定干擾Cul7的HTR8/SVneo細胞使用終濃度為20μg/ml的放線菌酮(CHX)處理，收集不同處理時間的細胞蛋白(0、2、4、8、12h)。Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，干擾Cul7表達后Notch1蛋白降解半衰期延長(圖4B)。Close 等[12]研究發(fā)現(xiàn)FBXW7可直接調(diào)控Notch1蛋白穩(wěn)定性，筆者通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將Flag-Notch1、HA-Cul7和HA-FBXW7真核表達質(zhì)粒導入細胞后使用Co-IP方法檢測蛋白結(jié)合情況。Western blot法檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)BXW7與Notch1結(jié)合，但Cul7蛋白與Notch1蛋白在人滋養(yǎng)層細胞中無結(jié)合(圖4C)。

圖4 Cul7對Notch1蛋白穩(wěn)定性的影響A.蛋白酶體抑制劑MG132處理；B.放線菌酮處理，箭頭所示為指向Notch1是位于下方的條帶；C.Co-IP檢測蛋白結(jié)合情況

討 論

Cullin-RING泛素連接酶如Cul1、Cul3、Cul4B和Cul7在小鼠和人胎盤發(fā)育中具有重要調(diào)控作用[13,14]。Chabrun等[15]報道Cul7 mRNA在宮內(nèi)遲緩發(fā)育(intrauterine growth retardation, IUGR)胎盤組織表達升高約10倍，在與子癇前期合并的IUGR組織表達升高約15倍。

Notch通路的異?？赡苁菍е绿ケP和滋養(yǎng)層功能異常妊娠疾病的發(fā)病機制[16]。Notch是絨毛外滋養(yǎng)層細胞(EVT)祖細胞標志物，在體外EVT形成過程中，檢測到Notch活性降低，表明Notch可能與滋養(yǎng)層前體的維持和分化有關[9]。Notch1水平的精確調(diào)節(jié)對于成功著床和蛻膜化是至關重要的，人絨毛膜促性腺激素介導的Notch1誘導可促進子宮基質(zhì)細胞的存活并啟動蛻膜化，其中Notch1下調(diào)和NUMB上調(diào)是完成分化所必需的[17]。

本研究首先觀察到Cul7基因敲除MEF細胞的Notch1蛋白表達升高，同樣觀察到干擾Cul7的HTR8/SVneo細胞中Notch1蛋白表達水平升高，而過表達Cul7后Notch1蛋白表達水平降低，提示Cul7在人滋養(yǎng)層細胞中負調(diào)控Notch1以及Notch1激活信號通路下游基因，是胎盤絨毛外滋養(yǎng)層細胞分化過程中新的Notch1負調(diào)控的關鍵因子。為了確定Cul7和Notch1的調(diào)控關系，筆者使用real-time PCR技術觀察到，與陰性對照比較，干擾Cul7后Notch1 mRNA表達水平變化不顯著，表明此機制非轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控。在使用蛋白酶體抑制劑MG132處理后，發(fā)現(xiàn)Cullin蛋白表達水平受到抑制時，Notch1及其下游靶基因分子表達顯著升高，提示Notch1在人滋養(yǎng)層細胞中可能受Cullin蛋白泛素化降解調(diào)控從而影響滋養(yǎng)層細胞的增殖和分化。使用放線菌酮處理后發(fā)現(xiàn)干擾Cul7使Notch1降解速率明顯降低，提示干擾Cul7導致Notch1泛素化降解受阻，從而延長其蛋白降解的半衰期。

本研究在HTR8/SVneo細胞中導入Flag-Notch1質(zhì)粒、HA-Cul7質(zhì)粒和HA-FBXW7質(zhì)粒，使用免疫共沉淀技術檢測結(jié)果顯示，外源性Cul7與Notch1無結(jié)合，提示Cul7在HTR8/SVneo細胞中可能通過協(xié)同其他泛素連接酶等間接作用抑制Notch1的蛋白表達。目前仍不清楚Cul7是泛素化降解Notch1還是抑制Notch1蛋白合成。Sun等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Cul1異常介導Neddylation導致P21積累從而調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞增殖分化并導致復發(fā)性自然流產(chǎn)，表明NEDD8-Cul1介導的P21降解在滋養(yǎng)層的正常發(fā)育中起重要調(diào)控作用，那么Cul7有可能通過Cul1間接泛素化降解Notch1，此機制還需進行更深入的探索。

綜上所述，本研究通過人滋養(yǎng)層細胞系采用蛋白質(zhì)相互作用等分子生物學手段，研究Cul7泛素化修飾和降解Notch1的分子機制，明確了Cul7在人滋養(yǎng)層細胞通過調(diào)控Notch1蛋白半衰期從而影響其穩(wěn)定性，進一步闡明了Cul7與Notch1的相互作用對滋養(yǎng)層細胞發(fā)育的調(diào)控和可能機制，可為胎兒生長受限及子癇前期和自然流產(chǎn)等妊娠疾病的研究提供新的思路和理論依據(jù)。