郝怡然 陳逸歌 李 彧 劉夢妤 劉 華

臨床研究發(fā)現(xiàn)各種腎臟疾病常伴有炎性反應(yīng)，而炎癥促進(jìn)腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展[1]。血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A，SAA)作為強(qiáng)效炎性因子，在炎癥和脂質(zhì)代謝中起關(guān)鍵作用[2]。SAA檢測有助于多種疾病的診斷和預(yù)后評估，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖、糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)[3～6]。最近的證據(jù)顯示SAA是炎癥通路的中樞介質(zhì)，SAA水平在DKD早期升高，促進(jìn)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[7]。高脂血癥常伴發(fā)于多種腎臟疾病，如腎病綜合征，是促進(jìn)腎小球硬化的危險(xiǎn)因素[8]。炎性因子可能與脂質(zhì)失衡共同參與了腎小球硬化的進(jìn)展，觀察炎性因子對細(xì)胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的影響是探討脂質(zhì)介導(dǎo)腎損傷的關(guān)鍵[9]。氧化低密度脂蛋白(oxidised low-density lipoprotein， Ox-LDL)植物血凝素樣受體1(lectin-like oxidised low-density lipoprotein receptor 1， LOX-1)在炎癥和脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)性疾病的發(fā)生、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[10～12]。炎性因子SAA對人腎小球系膜細(xì)胞(human mesangial cells，HMCs)LOX-1受體及脂質(zhì)代謝的相關(guān)研究較少。本研究通過觀察SAA對HMCs攝取脂質(zhì)及LOX-1受體表達(dá)的變化，探討炎癥在細(xì)胞水平影響HMCs脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的病理、生理機(jī)制。

材料與方法

1.材料：RPMI1640培養(yǎng)液及胎牛血清(Foetal calf serum，F(xiàn)CS)(美國Gibco Life Technologies 公司)，人腎小球系膜細(xì)胞由英國皇家醫(yī)學(xué)院腎臟病中心阮雄中教授惠贈，SAA(美國Peprotech Technologies公司)、Ox-LDL(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所)、油紅“O”(美國Sigma-Aldrich公司)，熒光Dil-Ox-LDL (美國Biomed Technologies公司)、LOX-1抗體(美國R&D Systems公司)。PCR反應(yīng)體系、反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(美國Promega Corporation公司)、dNTP、Oligo(dT)、引物(上海生物工程有限公司)合成，LOX-1引物序列：上游引物：5′-ACAGAGGCCATTCCGAAATCA-3′，下游引物：5′-GGTAGAGTCTGGAGATGGACCACA-3′。GAPDH 引物序列：上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3′，下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT -3′。

2.HMCs的培養(yǎng)：用10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液在5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)HMCs，0.01mol/L PBS沖洗，0.25%胰蛋白酶/0.025 EDTA消化，10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

3.油紅“O”染色：培養(yǎng)HMCs (5×104個(gè)/毫升)至亞融合狀態(tài)，靜止后將細(xì)胞隨機(jī)分組,對照組(0.2% RPMI1640)和SAA處理組(5ng/ml SAA+0.2% RPMI1640)，加入Ox-LDL(40mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24h，油紅“O”染色后觀察攝片。

4.流式細(xì)胞計(jì)數(shù)：培養(yǎng)HMCs至亞融合狀態(tài)，靜止后將細(xì)胞隨機(jī)分組，對照組、SAA組(5ng/ml SAA)和LOX-1受體阻斷+SAA組(2ng/ml 抗LOX-1抗體+5ng/ml SAA，抗LOX-1抗體提前2h應(yīng)用)，孵育12h各組加入10mg/L的熒光Dil-Ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)5h。PBS重復(fù)沖洗、消化、離心，制成細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)6000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算各組細(xì)胞內(nèi)平均熒光值。

5.實(shí)時(shí)定量PCR測定：培養(yǎng)HMCs至亞融合狀態(tài)，靜止后隨機(jī)分為3組，分別用含0、5、10ng/ml SAA的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h后收獲細(xì)胞，提取總RNA，合成cDNA，25μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，95℃10s，95℃15s，60℃30s，共擴(kuò)增45～50個(gè)循環(huán)。

6.Western blot法檢測：培養(yǎng)HMCs至亞融合狀態(tài)，靜止后隨機(jī)分為3組，分別用含0、5、10ng/ml SAA的培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h后收獲細(xì)胞，提取總蛋白。上樣100μg蛋白質(zhì)電泳，轉(zhuǎn)膜1h，封閉緩沖液過夜，0.2ng/L一抗與膜孵育，室溫緩慢振蕩2h，洗膜，1∶5000二抗室溫緩慢振蕩1h，洗膜，ECL顯影。

結(jié) 果

1.SAA促進(jìn)HMCs對Ox-LDL的攝?。河图t“O”染色發(fā)現(xiàn)HMCs攝取Ox-LDL，SAA組較對照組細(xì)胞內(nèi)紅染顆粒明顯粗大、增多，提示SAA增強(qiáng)HMCs對Ox-LDL的攝取(圖1)。

圖1 SAA(5ng/ml)促進(jìn)HMCs對Ox-LDL的攝取(油紅“O”染色，×200)A.對照組；B.SAA刺激組

2.流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)：HMCs攝取Dil-Ox-LDL，對照組HMCs平均熒光值為8.6，SAA組細(xì)胞內(nèi)平均熒光值為51.9，為對照組的6.03倍，提示SAA促進(jìn)HMCs攝取Dil-Ox-LDL，應(yīng)用抗LOX-1共孵育2h，阻斷組細(xì)胞內(nèi)平均熒光值為41.2，為對照組的4.79倍，降低為單純SAA刺激組的79.3%(圖2)。

圖2 SAA刺激及抗LOX-1抗體對HMCs攝入Dil-Ox-LDL的影響與對照組比較,*P<0.05；與SAA組比較,#P<0.05

3.SAA對LOX-1 mRNA表達(dá)的影響：SAA促進(jìn)LOX-1 mRNA的表達(dá)。用0、5、10ng/ml SAA刺激HMCs 12h，5ng/ml SAA組LOX-1 mRNA水平升高為對照組的5.12倍，10ng/ml SAA組LOX-1 mRNA水平達(dá)高峰，為對照組的6.97倍(圖3)。

圖3 不同濃度SAA作用12h對LOX-1 mRNA表達(dá)的影響與0ng/ml比較,*P<0.05

4.SAA對LOX-1 蛋白表達(dá)的影響：SAA促進(jìn)LOX-1蛋白的表達(dá)。用0、5和10ng/ml SAA刺激HMCs 12h，5ng/ml SAA組LOX-1蛋白水平升高為對照組的2.61倍，10ng/ml SAA組LOX-1蛋白水平達(dá)高峰，為對照組的3.15倍(圖4)。

圖4 不同濃度SAA作用12h對LOX-1蛋白表達(dá)的影響與0ng/ml比較 *P<0.05

討 論

研究表明，原發(fā)和繼發(fā)性腎臟疾病常伴發(fā)炎性狀態(tài)，如IgA腎病、狼瘡性腎炎，抗炎治療是有效的治療措施[13]。SAA作為急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在炎性反應(yīng)中迅速升高，并參與慢性炎性疾病的發(fā)展。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、代謝綜合征、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和DKD患者中SAA水平顯著升高[14～17]。近年來研究發(fā)現(xiàn)SAA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞形成泡沫細(xì)胞，抑制膽固醇的逆向運(yùn)輸，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)失衡，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成[18]。因此炎性因子SAA與高脂血癥共同參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。腎臟疾病常表現(xiàn)為炎性狀態(tài)，高脂血癥是腎臟疾病的獨(dú)立致病因素，因此研究炎癥導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)失衡的機(jī)制是闡明脂質(zhì)介導(dǎo)腎損傷的關(guān)鍵路徑，目前炎性因子SAA是否影響HMCs脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)尚不明確。

SAA可能通過LOX-1途徑促進(jìn)HMCs攝取Ox-LDL影響細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。既往研究表明腎小球硬化與動(dòng)脈粥樣硬化類似，是多種細(xì)胞因子參與的慢性炎癥過程。HMCs在生理?xiàng)l件下攝取Ox-LDL，通過自我調(diào)節(jié)與脂質(zhì)代謝相關(guān)受體的表達(dá)，維持細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)平衡。炎性因子可以打破脂質(zhì)水平介導(dǎo)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，導(dǎo)致大量攝入脂質(zhì)，最終超過其清除能力形成泡沫細(xì)胞[19]。高脂血癥的程度與腎小球硬化的程度不平行，近期研究顯示炎癥是加重脂質(zhì)異常導(dǎo)致腎損害的關(guān)鍵[20]。本研究表明，炎性因子SAA促進(jìn)HMCs攝取大量Ox-LDL，脂質(zhì)過度積聚導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成，HMCs來源的泡沫細(xì)胞可進(jìn)一步釋放細(xì)胞因子導(dǎo)致腎小球硬化，提示炎性因子SAA在細(xì)胞水平影響脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[21]。LOX-1作為Ox-LDL的重要受體，能特異性結(jié)合Ox-LDL，在內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞中廣泛表達(dá)。既往研究已經(jīng)證實(shí)，Ox-LDL可以正反饋刺激自身LOX-1受體，炎性因子進(jìn)一步促進(jìn)LOX-1表達(dá)，LOX-1-Ox-LDL通路可激活核因子-κB(NF-κB)等細(xì)胞因子，引發(fā)瀑布級聯(lián)樣炎性反應(yīng)[22]。本研究表明，SAA促進(jìn)HMCs攝取Ox-LDL，而抗LOX-1抗體可部分阻斷對Ox-LDL攝取，提示SAA可通過LOX-1受體途徑刺激HMCs攝取大量Ox-LDL。因此，SAA促進(jìn)HMCs通過LOX-1途徑攝取過度脂質(zhì)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β等細(xì)胞因子表達(dá)，促進(jìn)腎小球細(xì)胞增殖，提示LOX-1在腎小球硬化進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。

LOX-1是Ox-LDL的重要受體和關(guān)鍵炎性因子,SAA作為強(qiáng)有力的炎性介質(zhì)促進(jìn)LOX-1表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)SAA作為炎性因子在多種組織和細(xì)胞發(fā)揮促炎作用，導(dǎo)致代謝紊亂和動(dòng)脈粥樣硬化的形成。通過對肥胖患者的觀察發(fā)現(xiàn)，SAA水平可間接反映胰島素抵抗的程度。SAA可以抑制膽固醇的逆向運(yùn)輸升高血漿膽固醇濃度，進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。因此，SAA作為代謝綜合征和炎癥相關(guān)疾病的危險(xiǎn)因素得到廣泛重視。越來越多的證據(jù)表明，炎癥是DKD發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，SAA與DKD患者組織學(xué)嚴(yán)重程度相關(guān)，顯著參與DKD的進(jìn)展。SAA在高糖條件培養(yǎng)的足細(xì)胞和系膜細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步誘導(dǎo)炎性反應(yīng)促進(jìn)DKD特征性損害。因此，SAA介導(dǎo)的炎癥信號通路成為DKD新的生物學(xué)標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。SAA結(jié)合高密度脂蛋白通過NF-κB途徑刺激低密度脂蛋白受體缺陷小鼠腎臟LOX-1表達(dá)，促進(jìn)腎臟纖維化。高糖通過磷酸化絲裂原活化蛋白酶P38途徑誘導(dǎo)LOX-1的表達(dá)，增強(qiáng)Ox-LDL誘導(dǎo)的腎小管間質(zhì)細(xì)胞凋亡，為DKD的分子機(jī)制研究提供了新思路?？筁OX-1治療可能是逆轉(zhuǎn)血脂異常和DKD致病因素的有效方法，因此LOX-1在糖尿病和慢性腎臟病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。本研究提示SAA可能通過LOX-1途徑增強(qiáng)Ox-LDL攝取，促進(jìn)LOX-1表達(dá)，導(dǎo)致HMCs脂質(zhì)失衡轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，表明與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制類似，SAA水平升高是腎小球硬化的危險(xiǎn)因素，阻斷或拮抗SAA和LOX-1相關(guān)炎癥通路可能延緩DKD進(jìn)展。

綜上所述，炎性因子SAA通過LOX-1受體途徑促進(jìn)Ox-LDL攝取，而抗LOX-1抗體可降低對Ox-LDL攝取，SAA進(jìn)一步促進(jìn)LOX-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。因此，炎性因子SAA通過增強(qiáng)LOX-1受體表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)的攝取，影響細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步可激活多種細(xì)胞因子，促進(jìn)炎性反應(yīng)加重脂質(zhì)腎損害。SAA水平升高可能是DKD發(fā)展的危險(xiǎn)因素和生物學(xué)標(biāo)志物，然而仍需進(jìn)一步研究闡明具體致病機(jī)制，阻斷相關(guān)炎癥通路及脂質(zhì)代謝紊亂將是治療腎小球硬化的新靶點(diǎn)。