王景尚 尹曉丹 辛明蔚 武 穎 李憲銳 何軍琴

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡女性常見的一種生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂性疾病。據(jù)統(tǒng)計，我國育齡女性的發(fā)生率為5%～10%，是嚴重威脅我國女性生殖健康的重要原因之一，其中高達50%～70%的患者伴有胰島素抵抗(insulin resistance，IR)[1]。由于具有高發(fā)性、異質(zhì)性、終身性、難治性等特點，多囊卵巢綜合征伴胰島素抵抗(polycystic ovary syndrome rats with insulin resistance, PCOS-IR)患者已成為臨床和基礎(chǔ)研究的熱點及難點[2,3]。目前，臨床上多采用胰島素增敏劑治療PCOS-IR患者，盡管可有效改善患者IR、降低雄激素水平并在一定程度上恢復(fù)排卵，但也存在不良反應(yīng)較多、不能長期應(yīng)用且停藥后復(fù)發(fā)率高等不足[4]。近年來，中藥及其有效成分在治療PCOS、糖尿病及改善IR等方面的作用逐漸受到關(guān)注，為PCOS-IR治療藥物的開發(fā)提供了新的思路[5]。

西洋參莖葉總皂苷(panax quinquefolius saponin of stem and leaf，PQS)是西洋參的主要有效部位，廣泛應(yīng)用于糖代謝異常及其心血管疾病的治療。筆者課題組前期研究顯示，PQS對糖代謝異常及其并發(fā)癥有很好的療效，不僅可以降糖，還可顯著增加胰島素敏感度、改善IR、抗細胞凋亡[6]。那么，PQS對于PCOS-IR是否具有相似治療效應(yīng)？其機制如何？目前尚不清楚。為此，筆者開展了本研究，結(jié)果證實PQS能夠顯著糾正PCOS-IR模型大鼠的IR狀態(tài)、改善卵巢多囊樣改變，其機制可能與激活PI3K/Akt通路，調(diào)控Bcl-2、Bax表達有關(guān)。

材料與方法

1.材料：40只21～23日齡SPF級雌性SD大鼠，體質(zhì)量60±10g，購自北京大學(xué)實驗動物中心。高糖高脂飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，含豬油20%、蔗糖10%、膽固醇1.25%、膽酸鹽0.25%，普通飼料68.5%。PQS購自吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司，來曲唑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；血清促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、睪酮(testosteroneT)、空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、Tubulin抗體均購自Abcam；大鼠Bax、Bcl-2免疫組化試劑盒購自上海彩佑實業(yè)有限公司。

2.PCOS-IR模型構(gòu)建及給藥：大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只作為正常對照組，其余30只作為PCOS-IR模型組。對照組給予普通飼料，模型組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)28天。于喂養(yǎng)第8天，模型組大鼠開始每日用0.4ml溶于1%羧甲基纖維素溶液的來曲唑液[1mg/(kg·d)]灌胃，對照組灌服0.4ml 1%羧甲基纖維素溶液。自灌胃第7天開始每天早晨行陰道涂片，觀察陰道脫落細胞的周期變化，判斷動情周期。連續(xù)觀察至第21天，模型組大鼠均喪失完整動情周期。將造模成功大鼠隨機分為模型組、PQS高劑量組和PQS低劑量組，其中PQS低劑量組和PQS高劑量組分別進行PQS 30mg/kg、PQS 60mg/kg灌胃治療，對照組和模型組進行等劑量蒸餾水灌胃，連續(xù)干預(yù)4周。

3.樣本收集：模型組、PQS高劑量、PQS低劑量組大鼠灌胃結(jié)束后，在取材前一晚20：00時開始禁食禁水，次日用1%水合氯醛麻醉，尾靜脈采血，用羅氏血糖儀測定空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)水平并記錄。隨后經(jīng)腹主動脈取血，收集血清標(biāo)本置-80℃保存?zhèn)溆?。摘取雙側(cè)卵巢，一側(cè)放入4%多聚甲醛液固定，另一側(cè)放入凍存管中，置于液氮罐儲存，12h后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。對照組待大鼠均處于動情前期時，結(jié)束喂食，依照前法進行取血取材，以觀察基礎(chǔ)卵泡及性激素水平變化。

4.大鼠血清性激素水平測定：取大鼠血清，采用ELISA法測定大鼠血清卵泡刺激素(FSH)、促黃體生成素(LH)、睪酮(T)水平，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。

5.胰島素水平測定及胰島素抵抗程度評估：ELISA法測定空腹胰島素(FINS)水平。采用HOMA-IR指數(shù)評估IR程度，HOMA-IR指數(shù)計算方法：空腹血糖水平(FPG，mmol/L)×空腹胰島素水平(FINS，mU/L)/22.5。

6.HE染色法觀察大鼠卵巢組織學(xué)形態(tài)：取出經(jīng)4%多聚甲醛固定的卵巢組織，常規(guī)組織脫水，石蠟包埋；將卵巢組織切成5μm厚切片，常規(guī)脫蠟、水化后經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織病理學(xué)變化。

7.大鼠卵巢組織 Bax及Bcl-2的表達測定：免疫組織化學(xué)染色法測定大鼠卵巢組織中Bax及Bcl-2的表達，具體操作嚴格按照說明書進行。

8.Western blot法檢測卵巢組織中PI3K、p-PI3K、Akt、P-Akt表達：提取卵巢組織總蛋白，采用SDS PAGE凝膠電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，將PVDF膜放入封閉液(TBST /5% 脫脂奶粉)中，室溫封閉0.5h。分別加入一抗tubulin、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt孵育液4℃過夜，再與相應(yīng)二抗室溫孵育1h；再用TBST漂洗，ECL顯影。使用Quantity one軟件對其進行吸光度分析，以第1個孔的數(shù)值/tubulin的比值做為1。

結(jié) 果

1.PQS對PCOS-IR模型大鼠胰島素功能的影響：與正常組比較，模型組大鼠血清FINS水平及HOMA-IR指數(shù)均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，PQS高、低劑量組大鼠血清FINS水平及HOMA-IR指數(shù)均顯著降低(P<0.01，圖1)。

圖1 各組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR指數(shù)比較(n=10)與正常組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.01

2.PQS對PCOS模型大鼠血清性激素水平的影響:與正常組比較，模型組大鼠血清T、LH水平及LH/FSH比值均顯著升高(P<0.01)，F(xiàn)SH水平顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，PQS高、低劑量組大鼠血清T、LH水平及LH/FSH比值均顯著降低(P<0.01，圖2)。

圖2 各組大鼠血清性激素水平比較(n=10)與正常組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.01

3.PQS對PCOS-IR模型大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響：HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠鏡下可見多個不同發(fā)育時期的卵泡和黃體，極少見到囊性擴張卵泡，卵泡內(nèi)顆粒細胞層較厚，排列整齊，卵泡膜細胞8～9層(圖3A)；模型組大鼠的卵巢呈現(xiàn)出了典型的多囊樣改變，各級發(fā)育卵泡數(shù)量減少、有囊性擴張的卵泡、閉鎖卵泡、黃體組織比例減少、卵泡內(nèi)顆粒細胞層減少至2～3層，卵泡膜細胞增生(圖3B)；PQS低劑量組卵巢組織也可見到不同時期的卵泡和黃體，囊性擴張卵泡的數(shù)量較模型組明顯減少，卵泡內(nèi)顆粒細胞層較模型組增加(圖3C)；PQS高劑量組卵巢組織可見到不同時期的卵泡和黃體，囊性擴張卵泡的數(shù)量較模型組顯著減少，卵泡內(nèi)顆粒細胞層均有增加(圖3D)。

圖3 各組大鼠卵巢組織(HE,×100)A.對照組卵巢組織；B.模型組卵巢組織；C.PQS低劑量組卵巢組織；D.PQS高劑量組卵巢組織

4.PQS對PCOS模型大鼠卵巢顆粒細胞中Bcl-2和Bax表達的影響：與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中抗凋亡因子Bcl-2表達水平顯著降低，促凋亡因子Bax表達水平顯著升高(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著降低，模型組卵巢組織存在明顯損傷、凋亡顯著增加；與模型組比較，PQS高劑量組大鼠卵巢組織Bcl-2表達水平均顯著升高，Bax表達水平及Bcl-2/Bax比值均顯著降低(P<0.01)，PQS低劑量組變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。

圖4 各組大鼠卵巢顆粒細胞中Bcl-2和Bax表達情況比較(n=10)與正常組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.01

5.PQS對PCOS模型大鼠卵巢組織PI3K/Akt信號通路的影響：與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中p-PI3K、p-Akt表達水平顯著減少；與模型組比較，PQS低、高劑量組p-PI3K、p-Akt表達水平均顯著增加(圖5)。

圖5 各組大鼠卵巢組織PI3K/Akt信號通路蛋白表達情況比較(n=3)與正常組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.01，##P<0.01

討 論

PCOS以卵泡發(fā)育異常、持續(xù)無排卵、胰島素抵抗、雄激素過多及卵巢多囊樣改變?yōu)槠渲饕卣?。IR是PCOS病因研究中公認的主要發(fā)病原因之一，高胰島素血癥己明確可引起高雄激素血癥，高雄激素和高胰島素相互作用，促使大量卵泡發(fā)育而無優(yōu)勢卵泡形成[7,8]。本研究通過高糖高脂飲食聯(lián)合灌胃的方法，成功構(gòu)建了具有顯著IR、高雄激素血癥及卵巢多囊樣改變特征的PCOS-IR大鼠。研究結(jié)果顯示，PQS治療后大鼠血清T、FINS、LH水平及LH/FSH比值、HOMA-IR指數(shù)均顯著降低，卵巢組織多囊樣改變得到顯著改善，提示PQS能夠顯著改善PCOS-IR模型大鼠高胰島素血癥、胰島素抵抗、性激素水平異常，可使卵巢多囊樣改變得到顯著減輕，顯示出了很好的治療效應(yīng)。

卵泡發(fā)育異常是 PCOS患者持續(xù)不排卵和臨床內(nèi)分泌改變的主要病理基礎(chǔ)之一。大量研究顯示PCOS患者卵泡發(fā)育的異常與卵巢顆粒細胞的凋亡相關(guān)[9,10]。顆粒細胞的凋亡途徑主要有兩種，死亡受體途徑及線粒體凋亡途徑，在線粒體凋亡途徑的調(diào)控中，Bcl-2 家族起著關(guān)鍵作用。線粒體Bcl-2家族中促凋亡與抗凋亡蛋白的相互作用決定了線粒體凋亡途徑的激活與抑制。已有研究顯示PCOS大鼠卵巢顆粒細胞凋亡增加與Bcl-2家族蛋白表達失調(diào)相關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠卵巢組織中抗凋亡因子Bcl-2表達水平顯著降低，促凋亡因子Bax表達水平顯著升高，Bcl-2/Bax比值顯著降低，這與上述研究結(jié)果一致。PQS干預(yù)后Bcl-2表達水平顯著升高，Bax表達水平顯著降低，Bcl-2/Bax比值顯著提高，提示PQS可通過調(diào)控Bcl-2家族中促凋亡與抗凋亡蛋白，發(fā)揮改善PCOS-IR大鼠卵泡發(fā)育的作用。

PI3K/Akt 信號通路是體內(nèi)兩條重要的胰島素信號通路之一，不僅與胰島素抵抗密切相關(guān)，同時也對細胞的生長、凋亡具有顯著的調(diào)控效應(yīng)[12,13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路的調(diào)控異常與PCOS患者胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)，PI3K/Akt通路的內(nèi)在缺陷及后天因素導(dǎo)致的該通路活性下降是導(dǎo)致PCOS出現(xiàn)高胰島素血癥和高雄激素血癥的重要原因[14]。此外，研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt 信號通路在始基卵泡的激活、卵泡的募集、卵母細胞的減數(shù)分裂、早期胚胎的發(fā)育以及顆粒細胞增殖過程中均起著非常重要的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，PQS能夠顯著升高PCOS-IR模型大鼠卵巢組織中PI3K、Akt蛋白磷酸化水平，提示PQS具有促進卵巢組織PI3K/Akt通路激活的效應(yīng)，這可能是其治療PCOS-IR的作用機制之一。

綜上所述，本研究證實PQS可以顯著改善PCOS-IR大鼠的胰島素抵抗、糾正性激素異常及卵巢多囊樣改變，機制可能與其抑制PI3k/Akt信號通路的過度激活，調(diào)控Bcl-2與Bax分子表達相關(guān)。本研究初步證實了PQS對PCOS-IR的治療效應(yīng)與機制，將為開發(fā)新的PCOS-IR治療藥物提供實驗參考。