王 穎 吳 群 羅 莉 楊 柱 龍奉璽 唐東昕*

1.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,貴州 貴陽 550000;2.貴州省中醫(yī)腫瘤傳承與科技創(chuàng)新人才基地,貴州 貴陽 550000;3.貴航貴陽醫(yī)院,貴州 貴陽 550000

癌癥一直是世界范圍內(nèi)威脅人類生命健康的難題之一，也是世界范圍內(nèi)人類死亡的主要原因[1]。在我國，癌癥患者的死亡率較高，已成為我國居民死亡的首位因素[2-3]。中醫(yī)以其獨特的理論認識指導癌癥疾病的防治已有幾千年歷史，從《黃帝內(nèi)經(jīng)》時期至今不斷豐富、發(fā)展，在減毒增效，防止復發(fā)等方面均具有明顯優(yōu)勢[4-5]。運用現(xiàn)代科學技術方法來揭示中醫(yī)藥的科學內(nèi)涵是當今中醫(yī)藥繼續(xù)深入發(fā)展的重要內(nèi)容之一，也是豐富和發(fā)展中醫(yī)藥理論的有效途徑。

因此，本研究基于國醫(yī)大師劉尚義教授辨證治療惡性腫瘤的數(shù)據(jù)挖掘，以莪術-冬凌草藥對為例，從分子機制層面梳理和闡釋名醫(yī)經(jīng)驗。

莪術為姜科植物莪術的干燥根莖，出自《藥性論》，其性味溫、辛、苦，有消積破血、止痛行氣的功用[6-7]?，F(xiàn)代藥理學研究[7-9]證明，莪術揮發(fā)油具有抗癌、抗炎、保肝等作用，能通過延遲腫瘤細胞周期、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞對正常組織的侵襲來治療腫瘤疾病。冬凌草味甘、苦，其性寒，具有清熱、解毒、止痛、活血的功效。現(xiàn)代研究證明。冬凌草中的活性成分具有廣泛的抗腫瘤增殖活性、可以靶向地觸發(fā)不同腫瘤細胞系中的細胞周期停滯，凋亡和自噬通路，還具有抗炎、抗菌等作用[10-12]。在臨證治療惡性腫瘤中，國醫(yī)大師劉尚義教授常在組方中辨證使用莪術-冬凌草藥對治療多種惡性腫瘤[13]，如肝癌[14]、結直腸癌[15]、乳腺癌[16]等，在增強療效、減輕放化療副作用方面療效顯著，但其具體的分子生物機制尚不明確。

整合藥理學是一門包括中藥學、藥代動力學、計算科學等多學科融合的交叉學科，其主要研究方法包括大數(shù)據(jù)、網(wǎng)絡藥理學、體外活性評價研究以及數(shù)據(jù)挖掘，包含如中藥成分數(shù)據(jù)庫、疾病靶標數(shù)據(jù)庫等多個權威數(shù)據(jù)庫和多個數(shù)據(jù)分析方法，可以克服各個中藥分析方法和內(nèi)容之間關聯(lián)性不足等問題[17]。本研究借助中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0(http://www.tcmip.cn/)，探索莪術-冬凌草藥對抗癌的作用機制，為其臨床運用提供分子生物學理論依據(jù)。

1 方法

1.1 莪術-冬凌草藥對化學成分收集 在中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0 的中藥材和中藥成分數(shù)據(jù)庫中，分別收集莪術、冬凌草的化學成分，同時構建莪術-冬凌草化學成分數(shù)據(jù)庫。

1.2 莪術-冬凌草藥對靶點收集和分析 使用中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0 的中藥靶標數(shù)據(jù)庫，利用TCMIP數(shù)據(jù)庫的二維結構相似性搜索(MACCS分子指紋)方式，通過開源軟件進行特征提取, 再采用Tanimoto系數(shù)定義的相似度計量方法, 篩選相似性分數(shù)≥0.8的靶點作為候選靶點[18-20]。

1.3 疾病靶標收集 在中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0的疾病相關分子庫中，使用“cancer”作為關鍵字進行檢索，將檢索出的所有靶標作為疾病的候選靶標。

1.4 蛋白間相互作用(PPI)網(wǎng)絡構建 將莪術靶標、冬凌草靶標、癌癥靶標分別導入Venny 2.1在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制韋恩圖。再將莪術、冬凌草、癌癥的靶標導入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)中，選擇物種為“Homo sapiens ”，將滿足條件(degree大于中位數(shù))的靶標導入Cytoscape 3.7.0軟件，繪制莪術-冬凌草藥對靶標-疾病靶標相互作用的核心靶點網(wǎng)絡圖。

1.5 核心靶標基因生物過程分析 使用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在線工具對核心靶標進行GO功能分析和KEGG通路富集分析。

1.6 構建“藥對-活性成分-核心靶點-關鍵通路”網(wǎng)絡 使用Cytoscape 3.7.0軟件構建“藥物-活性成分-核心靶點-關鍵通路”的可視化多層次相關聯(lián)的整合網(wǎng)絡圖。

1.7 藥對核心成分藥代動力學分析 在中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0的中藥成分數(shù)據(jù)庫中，以藥物核心化學成分作為關鍵詞進行檢索，獲取其吸收、分布、清除、毒性的藥物性質(zhì)。

2 結果

2.1 莪術-冬凌草藥對化學成分及靶標預測分析 根據(jù)篩選條件，共在中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0中獲得莪術-冬凌草藥對化學成分174個，共有預測靶標843個。其中，莪術化學成分有141個，預測靶標有442個；冬凌草化學成分有35個，預測靶標有401個。合并去重后，共得到靶標246個。對篩選出的藥對靶標通過DAVID 6.8在線工具進行生物信息分析，分別取P值最小的10個功能富集進行分析(如圖1所示)。GO功能富集顯示，候選靶標的生物過程主要有離子轉(zhuǎn)運、對有機環(huán)狀化合物的應答、無機離子跨膜轉(zhuǎn)運等。KEGG通路富集顯示，候選靶標的信號通路主要有尼古丁成癮、cAMP信號通路、心肌細胞腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導等。

2.2 莪術-冬凌草藥對治療癌癥的核心靶標分析 在中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0的疾病相關分子庫中檢索到的癌癥的靶標共有390個，韋恩圖分析結果顯示，莪術-冬凌草藥對與癌癥共有19個交集的靶標，其中，屬于莪術的有13個靶標，屬于冬凌草的有17個靶標，二者共同靶標有11個。通過中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0數(shù)據(jù)庫，基于STRING 11.0數(shù)據(jù)庫中PPI相互作用，構建莪術-冬凌草藥對與癌癥靶標間相互作用網(wǎng)絡圖，根據(jù)篩選條件，共篩選出核心靶標191個，選取Degree值前100的靶標來構建核心靶標網(wǎng)絡圖(如圖2所示)。其中，莪術-冬凌草藥對直接作用靶標23個，癌癥靶標71個，藥對和疾病共有靶標6個。共有靶標分別為原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鈣調(diào)蛋白1、細胞周期蛋白依賴性激酶6、核因子NF-kappa-B p105亞基和前列腺素G / H合酶2。

注：由內(nèi)到外依次為共有靶標、藥對靶標、疾病靶標圖2 莪術-冬凌草藥對治療癌癥核心靶標網(wǎng)絡圖

2.3 核心靶標基因生物過程分析

2.3.1 莪術-冬凌草藥對關鍵靶點基因GO生物功能分析 使用DAVID 6.8在線工具對核心靶標中Degree值排在前100的靶標進行GO功能分析，共得到326個生物功能信息，取P值最小的前10位進行分析(表1，圖3)。結果發(fā)現(xiàn)，核心靶標主要富集于細胞對有機物的應答、大分子代謝過程的正調(diào)控、細胞對內(nèi)源性刺激的應答等與細胞代謝、調(diào)控、傳導等相關的生物過程。

圖3 莪術-冬凌草藥對治療癌癥核心靶標GO生物學功能氣泡圖

表1 莪術-冬凌草藥對治療癌癥核心靶標GO生物學功能信息

2.3.2 莪術-冬凌草藥對關鍵靶點基因KEGG通路富集分析 使用DAVID 6.8在線工具對核心靶標中Degree值排在前100的靶標進KEGG通路富集分析，取P值最小的前10位進行分析(表2，圖4)。結果發(fā)現(xiàn)，核心靶標主要富集于癌癥通路，IL-17信號通路，TNF信號通路等。

表2 莪術-冬凌草藥對治療癌癥KEGG通路信息

圖4 莪術-冬凌草藥對治療癌癥核心靶標KEGG通路氣泡圖

2.4 “藥對-活性成分-核心靶點-關鍵通路”多維網(wǎng)絡構建及分析 以2.3.2項中所富集分析出的P值最小的前十位KEGG通路來構建“藥對-活性成分-核心靶點-關鍵通路”多維網(wǎng)絡(圖5)。結果顯示，該多維網(wǎng)絡圖涉及了莪術-冬凌草藥對中39個成分和25個靶標。其中包括莪術成分20個，冬凌草成分19個。這些成分通過對半胱氨酸蛋白酶3、雌激素受體1、白細胞介素6、腫瘤壞死因子原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鈣調(diào)蛋白1、細胞周期蛋白依賴性激酶6、核因子NF-kappa-B p105亞基和前列腺素G / H合酶2等25個靶標的聯(lián)合調(diào)控，參與了癌癥通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、乙肝、雌激素信號通路、非酒精性脂肪肝等信號通路。其中原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鈣調(diào)蛋白1、細胞周期蛋白依賴性激酶6、核因子NF-kappa-B p105亞基和前列腺素G / H合酶2為莪術-冬凌草藥對與癌癥共有靶標。

經(jīng)過中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0數(shù)據(jù)庫進一步分析顯示，冬凌草中棕櫚酸通過與原癌基因c-Abl和鈣調(diào)蛋白1作用參與了癌癥通路；莪術中油松蛋白通過與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1作用參與了癌癥通路、雌激素受體通路、非酒精性脂肪肝、乙肝和TNF信號通路；莪術中油松蛋與冬凌草中毒馬草黃酮共同與細胞周期蛋白依賴性激酶6作用，參與了癌癥途徑；冬凌草中熊果酸、Guidongnin、冬凌草甲素、Rabdoternin C、冬凌草甲素C、冬凌草甲素H通過與核因子NF-kappa-B p105亞基作用參與了癌癥通路、雌激素受體通路、IL-17信號通路、乙肝、非酒精性脂肪肝、TNF信號通路；冬凌草中棕櫚酸通過與前列腺素G / H合酶2作用，參與癌癥途徑、IL-17信號通路和TNF信號通路。推測莪術-冬凌草藥對通過這些化學成分作用于原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鈣調(diào)蛋白1、細胞周期蛋白依賴性激酶6、核因子NF-kappa-B p105亞基和前列腺素G / H合酶2從而參與了癌癥通路、雌激素受體通路、IL-17 信號通路、乙肝、非酒精性脂肪肝、TNF信號通路，進而達到抗癌的作用。

2.5 莪術-冬凌草藥對核心成分藥代動力學分析 根據(jù)2.4中多維網(wǎng)絡分析結果，在中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺 V2.0中藥成分數(shù)據(jù)庫中，對作用于共有靶標的化學成分進行ADMET水平分析(表3)。根據(jù)ADMET 描述符[21]，吸收、代謝水平從0～3分別表示“良好”、“中等”、“弱”、“很弱”，血腦屏障分布水平從0～4分別表示“很高”、“高”、“中等”、“未闡明”，血漿蛋白結合率水平從0～2分別表示結合率<90%、結合率>90%、結合率>95%，肝毒性以0和1分別表示“無毒”“有毒”，而化學成分類藥性級別則根據(jù)中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0數(shù)據(jù)庫算出的類藥性比重來劃分，>0.67為“良好”、0.46～0.67為“中等”、<0.67為“弱”。

注：從上到下依次為為中藥藥對、藥物成分、核心靶點、紅色矩形為關鍵通路圖5 莪術-冬凌草藥對治療癌癥的“藥對-活性成分-核心靶點-關鍵通路”多維網(wǎng)絡圖

表3 莪術-冬凌草藥對核心成分藥代動力學分析

分析結果顯示，莪術-冬凌草藥對核心成分的吸收水平和代謝水平良好，藥物肝毒性主要是劑量依賴性的肝損傷，核心成分可以穿透血腦屏障，同時與血漿蛋白結合率較高，可以在抗癌治療中有效發(fā)揮作用。

3 討論

癌癥是一種全身性的疾病，任何單一治療都不能取得徹底、良好的療效。中西醫(yī)聯(lián)合治療癌癥，可以充分發(fā)揮各自優(yōu)勢，達到治療目的[4]。

本研究基于國醫(yī)大師劉尚義教授的臨床經(jīng)驗，以其常用的莪術-冬凌草藥對為例，借助中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0，探索莪術-冬凌草藥對抗癌的作用機制。通過中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺 V2.0數(shù)據(jù)庫共獲取莪術-冬凌草藥對174個化學成分，合并去重后，得到預測靶標共246個，同時基于STRING數(shù)據(jù)庫所構建的藥對靶標和疾病靶標PPI網(wǎng)絡，篩選出核心靶標，其中藥對與疾病共有的靶標分別為原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、鈣調(diào)蛋白1、細胞周期蛋白依賴性激酶6、核因子NF-kappa-B p105亞基和前列腺素G / H合酶2，推測這些靶標可能是莪術-冬凌草藥對抗癌的重要靶標。經(jīng)過GO生物功能和KEGG通路分析，這些藥物靶標主要參與細胞內(nèi)代謝、調(diào)控、傳導等相關信號傳遞的生物過程，核心靶標富集于多條與癌癥相關的信號通路，如癌癥通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、雌激素信號通路等。大約有20%的癌癥都與慢性炎癥有關，大多數(shù)實體腫瘤的炎癥浸潤都有促炎細胞因子介導[22]。白細胞介素17作為驅(qū)動自身免疫和炎性疾病的細胞因子，在癌癥進展、宿主防御、炎癥性疾病的發(fā)病等對多種過程中都有著非常重要的作用，同時其家族中的細胞因子也在炎癥誘導中起著核心作用[23-24]。研究證明[25-27]，IL-17信號傳導在多種癌癥的發(fā)生中都起到了重要作用，它可以介導炎癥發(fā)生，增強致癌基因的突變而促使癌癥的發(fā)生，并在腫瘤內(nèi)放大IL-17反應，從而促進組織再生，促進腫瘤生長和發(fā)展。作為主要的促炎癥細胞因子，腫瘤壞死因子參與了癌變的各個方面，在多種癌癥中充當了內(nèi)源性腫瘤啟動子[28-30]，在腫瘤中腫瘤壞死因子的生理濃度對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進作用，同時，腫瘤壞死因子可以通過誘導或上調(diào)下游趨化因子促進體內(nèi)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移以及血管生成[31-33]。雌激素是一種多效類固醇，在眾多的生理過程中都起到了調(diào)節(jié)的作用，除了介導與體內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關的生物學機制外，還參與多種激素敏感性癌癥如乳腺癌、前列腺癌等的生物過程，可以誘導腫瘤細胞的存活、增殖等[34-35]。

在預測出的莪術-冬凌草藥對活性成分中，直接作用于原癌基因c-Abl、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1等6個重要靶標的成分中，冬凌草中棕櫚酸可以通過ER應激促使細胞凋亡和自噬[36]。莪術中油松蛋白可作用于多種癌細胞，并通過調(diào)控相應靶標來抑制癌細胞的增殖、遷移，同時促使其凋亡[37-38]。另外，冬凌草中熊果酸、冬凌草甲素等均具有廣泛的抗炎、抗癌作用，在抑制腫瘤細胞增殖，促進其凋亡的同時，還可降低化療藥耐藥性[39-42]。

本研究通過中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0預測分析莪術-冬凌草藥對抗癌的核心靶標，并對核心靶標所參與的生物過程進行分析，在構建出的“藥對-活性成分-核心靶點-關鍵通路”多維網(wǎng)絡圖中，闡明莪術-冬凌草藥對抗癌的分子作用機制，其預測出的癌癥通路、TNF信號通路等相關通路均與文獻報道的癌癥發(fā)病機制相符，證明整合藥理學研究技術的全面性和可靠性。

本研究基于整合藥理學技術，從多個角度梳理了莪術-冬凌草藥對抗癌的潛在分子作用機制，結果顯示，莪術-冬凌草藥對是通過多靶點、多途徑來發(fā)揮的抗癌作用，為臨床運用提供依據(jù)，也為其后續(xù)實驗研究提供參考。