朱忠敏

亞臨界水提取靈芝酸性和中性三萜的工藝研究

朱忠敏

（福建仙芝樓生物科技有限公司，國家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，藥用菌栽培與深加工國家地方聯(lián)合工程研究中心，福州 350002）

為優(yōu)化亞臨界水提取靈芝酸性和中性三萜的工藝參數(shù)，采用正交試驗(yàn)方法，考察提取溫度、壓力、時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響，以HPLC法測(cè)定靈芝酸性和中性三萜含量。結(jié)果表明，亞臨界水提取靈芝三萜的優(yōu)化條件為料液比1︰16，溫度180 ℃，壓力4 MPa，提取時(shí)間10 min。此條件下靈芝酸性三萜得率為1.132 mg/g，中性三萜得率為0.582 mg/g。結(jié)論：亞臨界水提取靈芝酸性和中性三萜，較超臨界CO2提取方法成本低，較傳統(tǒng)的乙醇回流方法提取時(shí)間明顯縮短，且不含有機(jī)溶劑，是一種于環(huán)境友好的產(chǎn)業(yè)化提取技術(shù)。

亞臨界水提??；靈芝酸性和中性三萜；HPLC檢測(cè)

靈芝（）為多孔菌科真菌，藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，至今有兩千多年的歷史，是中華人民共和國藥典收載的法定中藥材，其主要藥用功能為“補(bǔ)氣安神，止咳平喘。用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食”[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，靈芝三萜是靈芝中的主要生物活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗菌抗病毒等多種功效[2-7]。

靈芝三萜可分為酸性三萜（靈芝酸）和中性三萜兩大類，國內(nèi)外研究多集中在靈芝酸性三萜，對(duì)于中性三萜研究較少，而實(shí)際上，中性三萜比酸性三萜具有更高的生物活性[8-9]，不僅能抑制增殖期的腫瘤細(xì)胞，而且能誘導(dǎo)休眠期腫瘤細(xì)胞的凋亡[10]。由于三萜化合物難溶于水，通常采用乙醇回流法、高壓超臨界CO2提取法及以乙醇為夾帶劑的超臨界CO2提取法提取靈芝三萜[11-15]。目前雖有報(bào)道亞臨界水提取靈芝酸研究[16]，但關(guān)注亞臨界水提取靈芝三萜的較少，我們采用正交試驗(yàn)方案，探索亞臨界水同步提取靈芝酸性和中性三萜的優(yōu)化工藝，以期為靈芝三萜的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

靈芝顆粒（赤靈芝119，由福建仙芝樓生物科技有限公司提供，經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心菌種鑒定）；靈芝三萜的對(duì)照品有靈芝酸A、靈芝酸B、靈芝酸C、靈芝酸C2、靈芝酸F、靈芝酸G、靈芝酸H、赤芝酸A、靈芝烯酸D和靈芝酮三醇等10個(gè)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供；甲醇（色譜級(jí)，廣東光華）；乙腈（色譜級(jí)，廣東光華）；冰醋酸（色譜級(jí)，廣東光華）；超純水（實(shí)驗(yàn)室自制，GWA-UN，北京普析通用）；乙醇（分析級(jí)，廣東光華）等。

1.2 儀器設(shè)備

亞臨界水提取裝置（500 mL，中國林業(yè)科學(xué)院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所定制設(shè)備）；液相色譜儀（LC-20A，日本島津）；超聲波清洗器（KQ-500，昆山超聲儀器）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（W2-100SP，上海申科）；色譜柱（LP-C18，4.6 mm′250 mm，5 μm，Welch）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 靈芝原料的預(yù)處理

將赤靈芝原料粉粹、過篩，取40～60目細(xì)顆?；旌暇鶆颍Q取25.0 g共12份，其中9份按正交試驗(yàn)方案做亞臨界水的提取實(shí)驗(yàn)，3份做最佳方案的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；另外稱取5.0 g二份，用于乙醇提取對(duì)比實(shí)驗(yàn)。提取獲得的提取液，經(jīng)過濾、濃縮、干燥，得提取物浸膏，作HPLC檢測(cè)用。

1.3.2 亞臨界水提取靈芝三萜的正交實(shí)驗(yàn)

9份25.0 g的靈芝原料，每份加水定容至400 mL（料液比1︰16），采用3因素3水平的L9(33)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)亞臨界水提取的特點(diǎn)，將主要參數(shù)溫度（℃）、壓力（MPa）和時(shí)間（min）設(shè)置為3因素。由于靈芝的植物纖維含量高，在亞臨界水提取溫度超過250 ℃時(shí)，會(huì)出現(xiàn)焦味碳化現(xiàn)象，因此將溫度因素的3個(gè)水平設(shè)置為不超過250 ℃，同時(shí)參照亞臨界水提取特性，分別設(shè)置壓力和時(shí)間的3水平（表1），以提取率（mg/g）為指標(biāo)。

表1 亞臨界水提取靈芝三萜因素和水平設(shè)計(jì)表

1.3.3 乙醇提取靈芝三萜的對(duì)比實(shí)驗(yàn)

二份5.0 g的靈芝顆粒原料，加入100 mL 95%乙醇（料液比1︰20），回流提取2 h，提取液經(jīng)過濾、減壓濃縮得提取物浸膏，做HPL檢測(cè)用。

1.3.4 靈芝三萜檢測(cè)

將1.3.1中得到的提取物浸膏，用95%乙醇超聲溶解，置于4 ℃冰箱冷藏過夜；第二天，取上清液濃縮，定容后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。由于酸性三萜和中性三萜的極性和最大紫外吸收波長(zhǎng)有差異，采用不同HPLC檢測(cè)方法，分別測(cè)定提取物中酸性三萜含量[9]和中性三萜含量[10-11]。方法如下：

（1）酸性三萜（靈芝酸）的HPLC檢測(cè)采用HPLC測(cè)定，用一測(cè)多評(píng)法計(jì)算[17-19]。HPLC的條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相（4.6 mm′250 mm，5 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.04%甲酸水為流動(dòng)相B，按表2設(shè)置進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)257 nm，柱溫為30 ℃，流速1.0 mL/min。理論塔板數(shù)按靈芝酸A峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。

表2 流動(dòng)相運(yùn)行梯度條件

分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，以一測(cè)多評(píng)法計(jì)算。對(duì)照品和供試品液相譜圖見圖1和圖2。

根據(jù)所得的各對(duì)照品和供試品的峰面積，分別計(jì)算被測(cè)定供試品溶液中各種靈芝酸的含量，酸性三萜的含量以9種三萜的含量之和計(jì)。供試品中各靈芝酸含量以提取率W計(jì)，數(shù)值以mg/g表示，按公式（E.1）計(jì)算。

式中：—樣品中各靈芝酸的提取率（mg/g）；—樣品中各靈芝酸的峰面積；—對(duì)照品溶液靈芝酸A峰面積；—對(duì)照品溶液中靈芝酸A濃度（mg/mL）；—相對(duì)校正因子；—供試品溶液體積（mL）；—用于制備供試品溶液的靈芝原料重量（g）。

（2）中性三萜（靈芝醇、酮和醛等）的HPLC檢測(cè)。目前，靈芝中性三萜的標(biāo)準(zhǔn)品稀少而昂貴，峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算。我們參照文獻(xiàn)[11]的

表3 相對(duì)校正因子表F

HPLC色譜條件進(jìn)行分析，用峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相（4.6 mm′250 mm，5 μm）；以甲醇為流動(dòng)相A，0.5%乙酸水為流動(dòng)相B，按表4設(shè)置進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)243 nm，柱溫為30 ℃，流速1.0 mL/min。理論塔板數(shù)按靈芝酮三醇峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。

表4 流動(dòng)相運(yùn)行梯度條件

測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積歸一化法計(jì)算。對(duì)照品和供試品液相譜圖見圖3和圖4。

根據(jù)所得對(duì)照品和供試品的峰面積，分別計(jì)算出被測(cè)定供試品溶液中所有中性三萜類物質(zhì)的含量，含量以提取率W計(jì)，數(shù)值以mg/g表示，按公式（E.2）計(jì)算。

式中：—樣品內(nèi)中性三萜類化合物的提取率（mg/g）；A—樣品內(nèi)中性三萜各峰面積總和；A—對(duì)照品溶液靈芝酮三醇峰面積；C—對(duì)照品溶液靈芝酮三醇濃度（mg/mL）；—供試校品溶液體積（mL）；—用于制備供試品溶液的靈芝原料重量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞臨界水提取靈芝酸性三萜正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可以看出，試驗(yàn)結(jié)果以A2B3C1組合方案的提取率最高，達(dá)1.038 mg/g。考慮到3因素3水平的組合共有81個(gè)，可能有其他組合方案提取率更高，按照“水平—提取率”的關(guān)系做進(jìn)一步計(jì)算分析[20]。首先將A因素第1、2、3水平的提取率相加，分別記為K1a(M1+M2+M3)=0.783、K2a(M4+ M5+M6)=0.993、K3a(M7+M8+M9)=0.190。以此類推，可得到B因素3個(gè)水平的提取率加和K1b(M1+ M4+M7)=0.604、K2b(M4+M5+M6)=0.688、K3b (M3+M6+M9)=0.674，C因素3個(gè)水平的提取率加和K1c(M1+M4+M7) =0.686、K2c(M4+M5+M6)=0.648、K3c(M3+M5+M7)=0.632。然后，取各因素的水平提取率加和最大值K2a、K2b、K1c，組合成A2B2C1為最佳方案。這個(gè)最佳方案的提取率會(huì)不會(huì)比組合A2B3C1更好呢？將在下面作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

1. 靈芝酸C2；2. 靈芝酸G；3. 靈芝酸B；4. 靈芝酸A；5. 靈芝酸H；6. 赤芝酸A；7. 靈芝烯酸D；8. 靈芝酸C；9. 靈芝酸F。

圖2 亞臨界水提取靈芝酸HPLC譜圖

圖3 靈芝酮三醇對(duì)照品HPLC譜圖

圖4 亞臨界水提取靈芝中性三萜HPLC譜圖

另一方面，計(jì)算各因素的極差R，即將該因素的K的最大值減去最小值。極差R越大的因素對(duì)提取率的影響越大，結(jié)果Ra的極差最大，得出溫度是影響提取率的最重要因素，其次是壓力，最小是時(shí)間。這與亞臨界水的提取時(shí)間短、提取效率高，溫度因素影響最顯著的特征相吻合[20-25]。

表5 亞臨界水提取靈芝酸性三萜的L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 亞臨界水提取靈芝中性三萜正交試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表6中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用表5的“水平—提取率”計(jì)算方法，獲得各因素的不同水平提取率最大加和K2a=0.478、K2b=0.313、K3c=0.307，組合成A2B2C1（溫度180 ℃，壓力4 MPa，時(shí)間10 min）為最佳方案。這與提取酸性三萜的最佳方案一致。同時(shí)，極差R也是Ra最大，即溫度對(duì)提取率影響最大，以下依次為壓力和時(shí)間。

2.3 最佳方案的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照上述得到最佳方案A2B2C1：料液比1︰16，溫度180 ℃，壓力4 MPa，時(shí)間10 min，重復(fù)試驗(yàn)3次，試驗(yàn)結(jié)果為靈芝酸得率1.132 mg/g，中性三萜化合物得率0.582 mg/g。

2.4 亞臨界水提取與傳統(tǒng)乙醇回流提取的比較

采用優(yōu)化的亞臨界水提取靈芝三萜方法與傳統(tǒng)的乙醇回流提取法進(jìn)行比較，以亞臨界水提取的最佳設(shè)計(jì)方案（料液比1︰16，在180 ℃、4 MPa下提取10 min）得到的靈芝酸提取率為1.132 mg/g、中性三萜提取率為0.582 mg/g；而乙醇回流提?。弦罕?︰20，80 ℃、常壓下提取120 min）的提取率是靈芝酸1.185 mg/g，靈芝中性三萜0.606 mg/g?？梢姡瑏喤R界水提取靈芝三萜的提取率基本與乙醇回流提取的相近，但提取時(shí)間大大縮短，僅為乙醇提取法的1/12，大幅降低了工業(yè)生產(chǎn)時(shí)間和能耗；且乙醇回流法乙醇成本較高，還潛存有機(jī)殘留風(fēng)險(xiǎn)。

表6 亞臨界水提取靈芝中性三萜的L9(33)正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié) 論

亞臨界水提取技術(shù)由于其無溶劑殘留、快速和節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已在食品工業(yè)、中藥和天然產(chǎn)物活性成分的提取[21-22, 24, 26-28]等方面獲得了廣泛的應(yīng)用。本文通過正交試驗(yàn)，得到亞臨界水提取靈芝酸性和中性三萜的優(yōu)化工藝條件，其提取率與傳統(tǒng)的乙醇回流法相近，但比后者更具綠色環(huán)保、省時(shí)節(jié)能、效率高等優(yōu)點(diǎn)。與高壓超臨界CO2提取法或以乙醇為夾帶劑的超臨界CO2提取法相比，成本低且無有機(jī)溶劑殘留，更適合應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，為靈芝三萜的提取應(yīng)用提供一種新途徑。

[1] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典[M]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2020,195-196.

[2] 劉維, 虎虓真, 朱莉, 等. 靈芝三萜的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2019, 40 (5) : 309-315.

[3] 李國華, 李曄, 梅錫玲, 等. 靈芝三萜類化合物研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2015, 46 (12) : 1858-1862.

[4] 孫培龍, 陶文揚(yáng), 何晉浙, 等. 靈芝中三萜類化合物的研究進(jìn)展[J]. 食藥用菌, 2016, 24 (2) : 76-81.

[5] Smina T P, Nitha B, Devasagayam T P, et al.total Triterpenoidss induce apoptosis in MCF-7 cells and attenuate DMBA induced mammary and skin carcinomas in experimental animals[J]. Mutat. Res, 2017(1): 813.

[6] Li X, Xie Y, Yang B B. Characterizing novel anti-oncogenic triterpenoids from ganoderma[J]. Cell Cycle, 2018, 17 (5): 527-528.

[7] Ruan W, Lim A H, Huang L G, et al. Extraction optimisation and isolation of triterpenoids fromand their effect on human carcinoma cell growth[J]. Nat. Prod. Res, 2014, 28(24): 2264-2272.

[8] Li P, Liu L, Huang S, et al. Anti-cancer Effects of a neutral triterpenoids fraction fromand its active constituents on SW620 human colorectal cancer cells[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2020, 20 (2): 237-244.

[9] 唐慶九, 季哲, 郝瑞霞, 等. 靈芝中性三萜類成分的抗腫瘤作用[J], 食用菌學(xué)報(bào), 2010, 17(1): 60-64.

[10] Dai J, Matthew A M, Nicholas J. Everetts, et al. Elimination of quiescent slow-cycling cells via reducing quiescence depth by natural compounds purified from[J]. Oncotarget, 2017, 8: 13770-13781.

[11] 南婷婷. 靈芝中性三萜組分的制備、質(zhì)量控制及抗腫瘤活性的研究[D]. 福州: 福建醫(yī)科大學(xué)碩士論文, 2015.

[12] Chen C, Li P, Li Y, et al. Anti-tumor effects and mechanisms ofextracts and spores oil[J]. ONCOLOGY LETTERS, 2016, 12: 3571-3578.

[13] 華正根, 王金亮, 朱麗萍, 等. 高壓超臨界CO2提取靈芝三萜和甾醇成分的研究[J]. 中國食用菌, 2018, 37 (5) : 62-65, 69.

[14] 章慧, 張勁松, 賈薇, 等. 超臨界CO2萃取靈芝子實(shí)體三萜工藝優(yōu)化及其與醇提法比較研究[J]. 食用菌學(xué)報(bào), 2011, 18 (3): 74-78.

[15] 宋師花, 賈曉斌, 陳彥, 等. 超臨界CO2萃取靈芝子實(shí)體中的三萜類成分[J]. 中國中藥雜志, 2008, 33(17): 2014-2017.

[16] 徐瑞聆，郭思揚(yáng)，王雅文, 等. 亞臨界水提取靈芝子實(shí)體中靈芝酸類成分的優(yōu)化[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2019, 34 (4): 393-395.

[17] T/CCCMHPIE1.49-2019. 植物提取物靈芝提取物（醇提）[S]. 中國: 中國醫(yī)藥保健品進(jìn)出口商會(huì), 2019.

[18] Liu W, Zhang J, Han W, et al. One single standard substance for the simultaneous determination of 17 Triterpenoidss inand its related species using high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr[J]. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2017, 1068 : 49-55.

[19] Da J, Cheng C R, Yao S, et al. A reproducible analytical system based on the multi-component analysis of Triterpenoids acids in[J]. Phytochemistry, 2015, 114: 146-154.

[20] 徐仲安, 王天保, 李常英, 等. 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法簡(jiǎn)介[J]. 科技情報(bào)開發(fā)與經(jīng)濟(jì), 2002, 19(5): 148-150.

[21] 張振巍, 李國慶, 仇繼璽, 等. 亞臨界提取技術(shù)在中藥領(lǐng)域的發(fā)展及應(yīng)用[J]. 中醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 29(197): 1494-1496.

[22] 鄭光耀, 薄菜穎, 張景利. 亞臨界水提取技術(shù)在植物提取物領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè), 2010, 30(5): 108-114.

[23] 吳其飛, 史嘉辰, 孫俊, 等. 農(nóng)產(chǎn)品亞臨界流體提取的理論研究現(xiàn)狀與趨勢(shì)[J]. 食品與機(jī)械, 2018, 34(7): 164-169.

[24] 蔡錦源, 王萌璇, 唐念, 等. 亞臨界水提取技術(shù)及其在有效成分提取和分析領(lǐng)域中的應(yīng)用[J]. 應(yīng)用化工, 2017, 46(6): 1210-1213.

[25] 王榮春, 盧衛(wèi)紅, 馬鶯. 亞臨界水的特性及其技術(shù)應(yīng)用[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(8): 373-377.

[26] 郭娟, 丘泰球, 楊日福, 等. 亞臨界水提取技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代化工, 2007, 27(12): 19-24.

[27] 張曉菲. 亞臨界水在食品中的應(yīng)用及發(fā)展前景[J]. 分析檢測(cè), 2018, 1: 67-70.

[28] 李新瑩, 劉興利, 馮豫川, 等. 亞臨界水提取在天然產(chǎn)物有效成分提取中的研究新進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技, 2012, 33(23): 414-418.

Study on acidic and neutral triterpenoids from Ganoderma lucidum by subcritical water extraction

Zhu Zhongmin

(Fujian Xianzhilou Biological Science ＆ Technology Co., Ltd; National R＆D Center For Edible Fungi Processing; Fujian Engineering Research Center for Medicinal Fungi; National and Local Joint Engineering Research Center for Cultivation and Deep Processing of Medicinal Fungi; Fuzhou, Fujian 350002, China)

In order to optimize the process parameters of acidic and neutral triterpenoids fromby subcritical water extraction (SWE).The effects of extraction temperature, pressure and time on the results were investigated by orthogonal test. The acidic and neutral triterpenoids ofwere determined by HPLC.The results showed thatthe optimum conditions of SWE extraction were: the solid-liquid ratio 1/16, tempereture 180 ℃,pressure 4 MPa, extraction time 10min. Under these conditions, the yield of acidic and neutral triterpenoids were 1.132 mg/g and 0.582 mg/g respectively. As an industrial extraction technology, the SWE is worthy for promotion, for its environmentally friendly, and compared with the supercritical CO2extraction, the SWE could reduce the costs. Compared with the traditional ethanol reflux method, the SWE could shorten the extraction time, and containing no organic solution.

subcritical water extraction; acidic and neutral triterpenoids from;HPLC

S567.3+1

B

2095-0934（2021）04-334-06

福州市市級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目—“一帶一路”及對(duì)外科技合作項(xiàng)目（2019－S－107）