趙瑞臣,次多,何春婭,胡佳佳,李素芝，馮東方

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是急診科常見(jiàn)病，其病理過(guò)程為胰酶在胰腺內(nèi)被激活后引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎性反應(yīng)，具體病因迄今尚不十分明確，多認(rèn)為與過(guò)量飲酒、膽結(jié)石、膽道感染等有關(guān)[1-2]。根據(jù)“中國(guó)急性胰腺炎診治指南”[3]可將AP分為輕度AP(mild acute pancreatitis，MAP)、中度AP(moderately severe acute pancreatitis，MSAP)和重度AP(severe acute pancreatitis，SAP)。在預(yù)后方面，雖然大部分輕度AP患者為自限性疾病，預(yù)后良好，但仍有近1/5會(huì)轉(zhuǎn)為MSAP或SAP。SAP病情進(jìn)展較快，并發(fā)癥多，治療難度大，病死率居高不下，嚴(yán)重威脅患者的生命安全。有研究表明[4]，當(dāng)胰腺受到損傷時(shí)，胰腺泡細(xì)胞釋放微小核糖核酸(microRNA，miR)，并在外周血中穩(wěn)定表達(dá)。另有研究表明[5-6]，miR-9、miR-155在胰腺損傷中異常表達(dá)，提示miR-9、miR-155可能在SAP的病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)分析SAP患者外周血中miR-9、miR-155的表達(dá)及其與血清淀粉酶(serum amylase，S-amy)、炎性反應(yīng)、輔助性T細(xì)胞17(helper T cells 17，Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)平衡的關(guān)系，以期為SAP診療提供參考，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年3月—2020年5月中國(guó)人民解放軍西藏軍區(qū)總醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科收治AP患者294例(病例組)及同期在醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康者51例(健康對(duì)照組)為研究對(duì)象。根據(jù)“中國(guó)急性胰腺炎診治指南”[3]中的分類標(biāo)準(zhǔn)，其中重度AP患者39例為SAP亞組，中度AP患者97例為MSAP亞組，輕度AP患者158例為MAP亞組。SAP亞組男26例，女13例，年齡18～71(45.73±7.26)歲；發(fā)病至入院時(shí)間4～9(6.23±1.86)h；基礎(chǔ)疾?。焊哐獕?1例，糖尿病3例；病因：高脂血癥性12例，膽源性18例，酒精性5例，特發(fā)性4例。MSAP亞組男66例，女31例，年齡19～75(46.57±7.79)歲；發(fā)病至入院時(shí)間4～10(6.29±1.72)h；基礎(chǔ)疾病：高血壓28例，糖尿病5例；病因：高脂血癥性33例，膽源性41例，酒精性12例，特發(fā)性11例。MAP亞組男105例，女53例，年齡19～76(46.64±7.81)歲；發(fā)病至入院時(shí)間4～9(6.27±1.78)h；基礎(chǔ)疾病：高血壓27例，糖尿病7例；病因：高脂血癥性49例，膽源性73例，酒精性20例，特發(fā)性16例。健康對(duì)照組男34例，女17例，年齡18～70(44.85±7.06)歲。4組對(duì)象的性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。3亞組發(fā)病至入院時(shí)間、基礎(chǔ)疾病、病因構(gòu)成比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(審批號(hào)：YZJQZYYLS20150109)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 入組選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①AP患者經(jīng)腹部超聲及腹部增強(qiáng)CT檢查，符合AP的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，患者胰腺形態(tài)改變，存在明顯的腹痛、腹脹、惡心、嘔吐等表現(xiàn)；年齡≥18歲，均為首次確診；②健康對(duì)照組經(jīng)肝功能、血尿常規(guī)、心電圖、X線胸片等檢查顯示無(wú)異常者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有肝炎、皰疹病毒感染者；②患惡性腫瘤及自身免疫性疾病者；③患有其他嚴(yán)重器質(zhì)性病變者；④入組前1個(gè)月內(nèi)服用過(guò)可能影響炎性指標(biāo)、Treg、Th17水平的藥物者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血標(biāo)本采集：AP患者于確診后(治療前)及健康對(duì)照組于體檢當(dāng)日采集清晨空腹外周血8 ml，均分為4份，每份2 ml，按相關(guān)規(guī)程保存待檢。

1.3.2 外周血miR-9、miR-155水平檢測(cè)：血樣本2 ml離心獲取血清，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)血清miR-9和miR-155表達(dá)量。血清在無(wú)菌無(wú)RNA酶條件下采用TRI Reagent BD試劑(美國(guó)Gene Copeia公司)提取總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用紫外分光光度計(jì)NanoDrop2000c(美國(guó)賽默飛世爾公司)檢測(cè)RNA濃度，樣品吸光度(A230/280)值在1.8～2.0保存待測(cè)。采用RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Gene Copeia公司)進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。miR-9和miR-155定量檢測(cè)采用U6為內(nèi)參基因，U6上游引物序列為5'-AGCGGGAACGTGCGTGACA-3'，U6下游引物序列為5'-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3'；miR-9上游引物序列為5'-GCGTCTITGGTTATCTAGCTGTA-3'，下游為5'-GCATGCTCATGAGCATCG’-3'；miR-155上游引物序列為5'-GCGAAAGCATTTGCCAAGAA-3'。下游為5'-CATCACAGACCTGTTATTGC-3'。RT-qPCR反應(yīng)體系總體積20 μl，RT-qPCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，95℃退火3 s，60 ℃延長(zhǎng)30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。miR-9和miR-155的相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT法計(jì)算[7]。

1.3.3 血清炎性指標(biāo)及淀粉酶檢測(cè)：上述血樣本2 ml離心獲取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定白介素6(IL-6)、IL-8、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，試劑盒購(gòu)自上海哈靈生物科技有限公司；另取血樣本2 ml離心獲取血清采用酶速率法(37℃)檢測(cè)S-amy水平，試劑盒購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司。檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.4 Th17、Treg水平檢測(cè)：取肝素鈉抗凝的外周血2 ml，常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞并提純，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，取1 ml加入流式細(xì)胞檢測(cè)專用試管，離心棄上清后加入磷酸鹽緩沖液100 μl，加入CD4單克隆抗體、CD25單克隆抗體、CD127單克隆抗體各20 μl，抗體與細(xì)胞懸浮液混勻，在室溫下避光孵育20 min，再次加入磷酸鹽緩沖液2 ml，混勻后再離心棄上清，加入0.5 ml磷酸鹽緩沖液重懸浮細(xì)胞，混勻后避光放置，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg。用于檢測(cè)Th17的樣本加入濃度為1 μl/ml的佛波酯(美國(guó)Sigma公司)0.5 μl，在37℃溫箱中培養(yǎng)1 h，再加入蛋白逆轉(zhuǎn)抑制劑2 μl，在37℃溫箱中培養(yǎng)3 h，加入磷酸鹽緩沖液2 ml洗滌，混勻后離心棄上清后加入CD4單克隆抗體30 μl，于4℃下避光孵育15 min，加入IL-17抗體5 μl，混勻后在4℃下避光孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液2 ml，混勻棄上清，再加入磷酸鹽緩沖液重懸浮細(xì)胞0.5 ml，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17。Th17、Treg檢測(cè)結(jié)果以陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示，并計(jì)算Th17/Treg比值。

2 結(jié) 果

2.1 各組miR-9、miR-155表達(dá)水平比較 外周血中miR-9、miR-155表達(dá)水平比較，SAP亞組>MSAP亞組>MAP亞組>健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組外周血miR-9、miR-155相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 各組血清炎性指標(biāo)及S-amy水平比較 血清IL-6、IL-8、TNF-α、CRP、S-amy水平比較，SAP亞組>MSAP亞組>MAP亞組>健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組血清炎性指標(biāo)及S-amy水平比較

2.3 各組Th17、Treg水平比較 Th17水平、Th17/Treg比較，SAP亞組>MSAP亞組>MAP亞組>健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Treg水平比較，SAP亞組

表3 各組Th17、Treg水平比較

2.4 miR-9、miR-155與炎性指標(biāo)、Th17、Treg、S-amy的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，外周血中miR-9、miR-155表達(dá)與IL-6、IL-8、TNF-α、CRP、Th17、Th17/Treg、S-amy呈正相關(guān)(P<0.05)，與Treg呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 miR-9、miR-155與炎性指標(biāo)、Th17、Treg、S-amy相關(guān)性分析結(jié)果

3 討 論

目前關(guān)于AP的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是炎性細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等)、炎性因子(如TNF-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、白介素、血小板激活因子等)之間相互作用從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)全身性炎性反應(yīng)，造成AP的早期病理?yè)p害[8-10]。IL-6是一種功能廣泛的多效性細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，是重要的炎性指標(biāo)之一。IL-8屬于趨化因子家族的細(xì)胞因子，IL-8結(jié)合IL-8受體α和受體β對(duì)中性粒細(xì)胞有細(xì)胞趨化作用，實(shí)現(xiàn)其對(duì)炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)功能。TNF-α是一種主要由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子，參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)過(guò)程。CRP是一種經(jīng)典的急性時(shí)相蛋白，其本身直接參與了炎性反應(yīng)過(guò)程，是一種非特異的炎性標(biāo)志物。湯偉勝等[11]研究顯示，SAP患者血清炎性指標(biāo)(IL-6、IL-8、IL-10、CPR)水平升高。張婷婷等[12]的研究表明，TLR4信號(hào)通路作為炎性反應(yīng)的閘門(mén)，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控炎性介質(zhì)的釋放，引起SAP患者各器官損傷。Matsuda等[13]的研究也表明，炎性反應(yīng)與AP病情密切相關(guān)。本研究中，IL-6、IL-8、TNF-α、CRP的表達(dá)水平比較，SAP亞組>MSAP亞組>健康對(duì)照組，表明AP患者機(jī)體存在炎性反應(yīng)，且炎性反應(yīng)水平與病情程度有關(guān)。在正常機(jī)體狀態(tài)下，炎性因子與炎性細(xì)胞保持動(dòng)態(tài)平衡，在AP病理過(guò)程中，會(huì)發(fā)生促炎—抑炎之間的失衡，從而打破原有的動(dòng)態(tài)平衡，機(jī)體狀態(tài)向促炎一方極化，引發(fā)機(jī)體多個(gè)器官受損[14]。

Th17細(xì)胞通過(guò)分泌IL-17參與炎性反應(yīng)的過(guò)程，IL-17可激活免疫T細(xì)胞活性，產(chǎn)生化學(xué)增活素、細(xì)胞黏附分子等，從而介導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生[15]。Treg細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞亞群之一，其主要分泌特異性表達(dá)叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子，具有免疫抑制作用，通過(guò)分泌IL-10、IL-4等細(xì)胞因子維持體內(nèi)免疫環(huán)境的穩(wěn)定[16]。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分化過(guò)程是相互拮抗的，在正常機(jī)體狀態(tài)下，二者通過(guò)免疫網(wǎng)絡(luò)保持抗炎—抑炎平衡，當(dāng)機(jī)體損傷時(shí)，抗炎—抑炎的平衡被打破，對(duì)機(jī)體免疫起負(fù)調(diào)節(jié)作用[17]。本研究顯示，Th17細(xì)胞、Th17/Treg水平比較，SAP亞組>MSAP亞組>MAP亞組>健康對(duì)照組；Treg水平比較，SAP亞組

miRNA是一類由21～25個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子核糖核酸，其生物學(xué)功能是參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、激素調(diào)節(jié)和新陳代謝等過(guò)程[20]。目前有研究[21]證實(shí)，miRNA與腫瘤、心血管病、腦血管病等多種疾病有關(guān)，miRNA通過(guò)特定的細(xì)胞因子和信號(hào)通路對(duì)Th17和Treg細(xì)胞的分化進(jìn)行調(diào)節(jié)，并在分子水平上介導(dǎo)Th17與Treg細(xì)胞的平衡，參與免疫應(yīng)答的過(guò)程。但目前關(guān)于miR-9、miR-155與SAP關(guān)系的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，外周血中miR-9、miR-155的表達(dá)水平比較，健康對(duì)照組MSAP亞組>MAP亞組>健康對(duì)照組，表明AP患者血清淀粉酶升高，這一觀點(diǎn)在以往研究中也得到證實(shí)[24-25]。進(jìn)一步的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，外周血中miR-9、miR-155的相對(duì)表達(dá)量與IL-6、IL-8、TNF-α、CRP、Th17細(xì)胞、Th17/Treg、S-amy的表達(dá)水平呈正相關(guān)，與Treg細(xì)胞水平呈負(fù)相關(guān)。其機(jī)制可能是：每個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)不同的轉(zhuǎn)錄因子，一個(gè)靶基因也可以被幾個(gè)miRNA同時(shí)調(diào)節(jié)，miR-9、miR-155通過(guò)靶基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白1、Smad2 分別正負(fù)向調(diào)控Stat3通路和Smad通路，從而調(diào)控Th17和Treg細(xì)胞的表達(dá)水平，影響炎性反應(yīng)與免疫應(yīng)答[26]。表明miR-9、miR-155可能通過(guò)影響炎性反應(yīng)、免疫平衡和淀粉酶的釋放參與SAP的病理過(guò)程。

本結(jié)果表明，SAP患者外周血中miR-9、miR-155表達(dá)與血清淀粉酶、炎性指標(biāo)水平及Th17/Treg平衡有關(guān)，但只是初步分析相關(guān)性，今后可從細(xì)胞株、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析miR-9、miR-155與SAP病理過(guò)程的關(guān)系及具體機(jī)制，并探究二者對(duì)SAP的臨床診斷價(jià)值。

綜上所述，SAP患者外周血miR-9、miR-155表達(dá)上調(diào)，其可能通過(guò)影響炎性反應(yīng)、免疫平衡、淀粉酶參與AP的病理變化過(guò)程，檢測(cè)外周血miR-9、miR-155表達(dá)水平對(duì)SAP的診療具有一定意義，可進(jìn)行深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

趙瑞臣：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫(xiě)；次多、何春婭：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改；胡佳佳、李素芝：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；馮東方：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核