金芬，周英惠，張吉，郭偉堃

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530001

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）指具有生長(zhǎng)功能的子宮內(nèi)膜組織（腺體和間質(zhì)）出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜腔被覆黏膜及宮體肌層以外的雌激素依賴(lài)性疾?。?］。育齡期是子宮內(nèi)膜異位癥的高發(fā)年齡，子宮內(nèi)膜異位癥的患病率為9.5%，25%～40%不孕患者與此病有關(guān)，20%～90%慢性盆腔疼痛及痛經(jīng)患者存在子宮內(nèi)膜異位癥［2-3］。子宮內(nèi)膜異位發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，治療方法有局限性。該病的發(fā)生率呈明顯上升趨勢(shì)，患者經(jīng)常出現(xiàn)如月經(jīng)間期出血、痛經(jīng)、性交疼痛、大便困難和尿痛等［4］。因此，積極防治子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生，減輕和控制疼痛，治療和促進(jìn)生育對(duì)育齡期婦女的身心健康具有重要的意義。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，子宮內(nèi)膜異位癥的異位內(nèi)膜有周期性地出血，屬“離經(jīng)之血”，其病位在下焦，女子胞。《血癥論》“既然是離經(jīng)之血，雖清血、鮮血，亦是瘀血”。因此，子宮內(nèi)膜異位癥最基本的病理基礎(chǔ)為血瘀。桂枝茯苓丸出自《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治》，具有活血化瘀、緩消癥塊之功效。研究表明，桂枝茯苓丸能抑制異位內(nèi)膜血管生長(zhǎng)［5-6］，使異位內(nèi)膜萎縮、壞死［7］，緩解疼痛［8-9］，提高妊娠成功率［10］，對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的治療具有明顯療效［11-13］。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用機(jī)制，闡明桂枝茯苓丸中藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理，為臨床使用桂枝茯苓丸提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 桂枝茯苓丸的分子化合物及靶點(diǎn)通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索桂枝茯苓丸所包含的5味中藥，即桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍中各味中藥的分子化合物，篩選符合生物利用度（oral availability，OB）大于30%，類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）大于0.18的候選藥物分子化合物，獲取候選分子化合物對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，整理后導(dǎo)入Excel表格。

1.2 子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)OMIM（https：//omim.org/）數(shù) 據(jù) 庫(kù) 及GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)以“endometriosis”作為關(guān)鍵詞檢索子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)靶點(diǎn)，將得到的靶點(diǎn)信息保存在Excel表格，合并后去除重復(fù)，得到子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 中藥-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)用R軟件將中藥靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)的靶點(diǎn)名稱(chēng)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)ID，去除重復(fù)的靶點(diǎn)，得到中藥預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集，進(jìn)行映射，兩者取交集后所得的重復(fù)靶點(diǎn)視為桂枝茯苓丸作用于子宮內(nèi)膜異位癥的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，并繪制venny圖。運(yùn)用STRING軟件構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interation，PPI），應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建桂枝茯苓丸與子宮內(nèi)膜異位癥的中藥-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，然后進(jìn)行拓?fù)浞治霁@得自由度大于2的核心蛋白，并選取前30個(gè)核心蛋白繪制柱狀圖。

1.4 GO及KEGG富集分析使用GO數(shù)據(jù)庫(kù)及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)方藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因功能及靶點(diǎn)通路分析，以“P＜0.05，基因數(shù)≥10”作為節(jié)點(diǎn)，得到桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥可能性較大的基因功能及作用機(jī)制通路。

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓丸篩選出的分子化合物以O(shè)B大于30%，DL大于0.18作為篩選條件，經(jīng)篩選得到桂枝7個(gè)化合物，茯苓15個(gè)化合物、牡丹皮11個(gè)化合物、桃仁23個(gè)化合物、赤芍30個(gè)化合物，刪除重復(fù)化合物，共得到76個(gè)候選化合物。

2.2 桂枝茯苓丸中分子化合物相關(guān)的靶基因桂枝茯苓丸共有238個(gè)驗(yàn)證靶點(diǎn)及272個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，使用R軟件將靶點(diǎn)名稱(chēng)轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)ID，去除重復(fù)ID的靶點(diǎn)后，得到184個(gè)藥物靶點(diǎn)，共獲得1 403個(gè)子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 構(gòu)建中藥-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)得到桂枝茯苓丸有效成分及靶點(diǎn)、子宮內(nèi)膜異位癥各靶點(diǎn)的關(guān)系即藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)（圖1），篩選出桂枝茯苓丸作用于子宮內(nèi)膜異位癥的有效成分有endometriosis、（-）-taxifolin、guizhifulinwan、betasitosterol、sitosterol、（＋）-catechin、ent-epicatechin、taxifolin、mairin、kaempferol等共38種，這些化合物作用于PTGS1、PTGS2、PGR、NCOA2、SLC6A4、OPRM1、BCL2、BAX、CASP9、JUN、CASP3、CASP8、PON1、MAP2等135個(gè)疾病靶點(diǎn)。映射構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2），得出99個(gè)有效靶點(diǎn)，共1 747條相互作用關(guān)系，平均自由度為35.3，聚合系數(shù)為0.9。節(jié)點(diǎn)的自由度表示在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中與節(jié)點(diǎn)直接相互作用的節(jié)點(diǎn)數(shù)目，節(jié)點(diǎn)的自由度越大，則其參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)。經(jīng)過(guò)對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，選取自由度為前30的蛋白作為核心蛋白，得到AKT1、IL-6、VEGFA、JUN、MAPK8、PTGS2、CASP3、EGF、MAPK1、EGFR等30個(gè)Hub蛋白（表1）。

圖2 桂枝茯苓丸靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

表1 Hub蛋白

圖1 桂枝茯苓丸-靶點(diǎn)-子宮內(nèi)膜異位癥網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶基因相關(guān)的功能及通路富集分析通過(guò)GO分析探討桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的功能分布，富集通路共120條。其中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的分子生物功能有：染色質(zhì)結(jié)合（chromatin binding）、蛋白質(zhì)異二聚體化活（protein heterodimerization activity）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、輔助因子結(jié)合（cofactor binding）和近端啟動(dòng)子序列特異性DNA結(jié)合（proximal promoter sequencespecific DNA binding）等靠在前列。通過(guò)KEGG通路探討桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的通路分布，富集結(jié)果包括：人類(lèi)巨細(xì)胞病毒感染（human cytomegalovirus infection）、卡波西肉瘤相關(guān)的皰疹病毒（kaposi sarcoma-associated herpesvirus）、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAG信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、乙型肝炎（hepatitis B）、流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、丙型肝炎（hepatitis C）、P13K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、前列腺癌（prostate cancer）、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路（TNF signaling pathway）等共150條。

功能富集（圖3）及通路富集（圖4）結(jié)果排在前20條通路以氣泡圖直觀表示，節(jié)點(diǎn)的顏色與大小由相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量和P值決定，顏色從藍(lán)色到紅色反應(yīng)P值從大到小，節(jié)點(diǎn)從小到大反映了相關(guān)聯(lián)基因的數(shù)量從少到多。

圖3 CO分析氣泡圖

圖4 KEGG富集通路氣泡圖

3 討論

桂枝茯苓丸為復(fù)方中藥，具有多成分、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)調(diào)節(jié)的特點(diǎn)。由Hopkins［14］提出的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，可以構(gòu)建中藥復(fù)方-中藥-有效成分-藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)中藥中多靶點(diǎn)相互作用效果以及中藥復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法檢索篩選出藥物及疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，預(yù)測(cè)桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥的有效成分、靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路。

桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍5味中藥組成。方中桂枝溫通血脈，牡丹皮、芍藥涼血散瘀，桃仁破血消癥，茯苓滲濕祛痰，運(yùn)用此方治療子宮內(nèi)膜異位癥，具有活血化瘀、緩消癥塊的功效。本研究篩選出桂枝丸的有效成分及靶點(diǎn)后，與子宮內(nèi)膜異位癥的疾病靶點(diǎn)取交集，并通過(guò)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)得出有效靶點(diǎn)，并篩選出AKT1、IL-6、VEGFA等30個(gè)核心蛋白，參與多種生物調(diào)節(jié)過(guò)程，主要包括物質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖、分化、遷移、轉(zhuǎn)化和程序性細(xì)胞死亡、血管生成、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)。通路富集分析發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)的分子生物功能120條及所在的生物通路150條，發(fā)現(xiàn)其治療子宮內(nèi)膜異位癥可能主要通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、抗血管生成、抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、抗腫瘤等機(jī)制。在上述信號(hào)通路中，AGE/RAGE信號(hào)通路主要與抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)。糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）的主要受體稱(chēng)為糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE或AGER），屬于免疫球蛋白超家族，被稱(chēng)為模式識(shí)別受體。AGE/RAGE信號(hào)通路可激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPKs，進(jìn)而導(dǎo)致-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活化。NF-κB是一種幾乎存在于所有細(xì)胞類(lèi)型的多效性轉(zhuǎn)錄因子，是一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的終末點(diǎn)，可促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、TNF-α［15］和多種動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)基因的表達(dá)，包括VCAM-1、VEGF和RAGE。此外，通過(guò)RAGE誘導(dǎo)JAK-STAT介導(dǎo)的通路和PI3K-Akt依賴(lài)通路，分別參與細(xì)胞增殖和凋亡。其治療子宮內(nèi)膜異位癥可能通過(guò)抑制NF-κB、IL-6、IL-8及CCL2等趨化因子，從而抑制炎癥反應(yīng)。已有相關(guān)臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，桂枝茯苓丸可通過(guò)抑制炎性因子分泌阻斷單核巨噬細(xì)胞活化及炎性浸潤(rùn)，減輕異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的黏附、增殖及纖維合成［16-19］，進(jìn)而延緩疾病的進(jìn)展。

本研究中多個(gè)信號(hào)通路如Human cytomegalovirus infection、AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Fluid shear stress and atherosclerosis等均涉及VEGF表達(dá)，VEGF為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，在血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)中起作用，其誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移、抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)血管通透化。桂枝茯苓丸可能通過(guò)降低VEGF表達(dá)［20-21］、抑制血管生成［22］、阻礙子宮內(nèi)膜異位病灶區(qū)生長(zhǎng)，達(dá)到延緩子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展，這與林立鵬等［23-24］的研究一致。從桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)通路，如Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection、Prostate cancer、Colorectal cancer等通路中，桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥還可能通過(guò)細(xì)胞周期阻滯、抑制細(xì)胞分化、抗腫瘤等機(jī)制。通過(guò)調(diào)控腫瘤相關(guān)信號(hào)通路中JUN、p21、原癌基因（Myc）、細(xì)胞周期蛋白D1（cycD1）等分子活性，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖［25-26］、分化和凋亡，抑制子宮內(nèi)膜組織的生長(zhǎng)［27］。

綜上所述，本研究從分子水平上探討了桂枝茯苓丸治療子宮內(nèi)膜異位癥主要活性成分和潛在的分子作用機(jī)制，為后續(xù)該藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量控制提升及作用機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。