崔江波，楊靜，王培福，張綠明，韓柏林，杜繼臣

(1.北京大學(xué)航天臨床醫(yī)學(xué)院；2.航天中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100049)

腦缺血指的是大腦血流量不足以滿足新陳代謝需求，進(jìn)而導(dǎo)致腦缺氧、腦組織死亡、腦梗死或缺血性腦卒中的現(xiàn)象[1]。腦缺血是一種發(fā)病率和死亡率高的常見病，與腦血管病有關(guān)，缺血性腦血管病占總腦血管病的70%[2]。盡管腦缺血后血液再灌注對于減輕腦功能障礙和腦損傷至關(guān)重要，但有時也會加重腦損傷[3]。因此，腦缺血再灌注損傷的防治在缺血性腦血管病的治療中有著十分重要的意義。然而，腦缺血再灌注損傷的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚。研究[4]表明缺血性腦損傷涉及多種因素，包括細(xì)胞凋亡、酸中毒、離子失衡、興奮性毒性、氧化應(yīng)激以及炎癥等。此外，包括磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase，Akt)/哺乳動物的雷帕霉素(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路在內(nèi)的多種信號通路也參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制[5]。蒿本內(nèi)酯是我國傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸和川芎的生物活性成分，可改善血液循環(huán)及調(diào)節(jié)免疫[6]。另有報道[7]表明，蒿本內(nèi)酯具有明顯的抗炎作用，對腦缺血再灌注損傷起神經(jīng)保護(hù)作用。基于此，本研究擬建立腦缺血再灌注損傷大鼠模型，通過基于PI3K/Akt/mTOR信號通路分析蒿本內(nèi)酯對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制，旨在為腦缺血再灌注損傷臨床治療提供可靠根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康、清潔級別的SD雄性大鼠由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，體重為230～250 g，許可證號：SCXK(京)2019-0010。大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實驗室中，溫度控制為(21±2)℃，相對濕度控制為(50±5)%，給予12 h光處理/暗處理交替，使大鼠自由攝食、飲水。

1.2 藥品與試劑

蒿本內(nèi)酯(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度>98%)；PI3K抑制劑LY294002(美國MCE公司，貨號HY-10108)；組織蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；10%水合氯醛、4%多聚甲醛、TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(北京鼎國生物制品公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR溶液(TaKaRa，貨號分別為：RR047A、DRR420A)；兔抗大鼠PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt、mTOR、p-mTOR一抗(美國CST公司，貨號分別為：4249、4691、17366、4060、2983、5536)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(北京博爾邁生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠局灶性腦缺血(middle cerebral arteryocclusion，MCAO)再灌注損傷模型制備 采用改良大腦中動脈線栓法制作大鼠MCAO再灌注損傷模型[8]。首先，腹腔注射10%的水合氯醛(3 mL/kg)，使得大鼠麻醉，麻醉72 h；接著將大鼠仰臥位固定，將其頸部毛發(fā)剪除干凈，于頸部旁正中線作切口，使其頜下腺體鈍性分離，并分離出右側(cè)頸總動脈和分支頸外動脈、頸內(nèi)動脈，縫合分支頸外動脈，用血管夾夾閉頸內(nèi)動脈，并用顯微剪在頸總動脈主干上剪出一個小口，插入魚線線栓，取出血管夾，將線栓向里推進(jìn)，直到標(biāo)記點時遇到阻力則停下，此時線栓頭端已通過大腦中動脈根部，可阻塞右側(cè)大腦中動脈血流；剪斷線栓，還原頜下腺，縫合皮膚，使用有生理鹽水的紗布覆蓋切口；待大鼠腦缺血2 h后，將縫合線剪開，并緩慢將線栓取出，扎緊結(jié)扎線，使其大鼠右側(cè)大腦中動脈血流恢復(fù)2 h，進(jìn)而實現(xiàn)腦缺血再灌注，縫合皮膚，觀察大鼠直至其麻醉清醒后，將其放回鼠籠。參照神經(jīng)行為學(xué)評分[8]對建模后的大鼠進(jìn)行評估，評分1～3分表示建模成功。將建模成功的大鼠隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、模型組、蒿本內(nèi)酯組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組，每組各10只。腦缺血再灌注后1 h，蒿本內(nèi)酯組予以蒿本內(nèi)酯(20 mg/kg)靜脈注射，蒿本內(nèi)酯+LY294002組予以蒿本內(nèi)酯(20 mg/kg)+LY294002(20 nM/mL)靜脈注射，假手術(shù)組和模型組予以等量生理鹽水，持續(xù)7 d。

1.3.2 神經(jīng)行為學(xué)評分 末次給藥24 h后，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。正常，無神經(jīng)功能損傷記為0分；左前爪無法完全舒展，輕度受損記為1分；行走時往對側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度損傷記為2分；行走時往對側(cè)傾倒，記為3分；無法自發(fā)行走，喪失意識記為4分。

1.3.3 腦梗死體積測定 采用10%的水合氯醛(3 mL/kg)對各組大鼠進(jìn)行腹腔注射，將其胸部皮膚剪開，暴露其心臟，夾閉下腔靜脈，將大鼠右心耳剪開，斷頭取腦；取腦組織切成2 mm切片，并置入2%的TTC中，放入37 ℃恒溫箱中，30 min后取出置入4%的多聚甲醛中，固定，24 h后拍照，并使用Image pro軟件對大鼠腦梗死體積進(jìn)行測定[9]。

1.3.4 TUNEL法 取腦組織固定24 h，脫水，進(jìn)行石蠟包埋；常規(guī)脫蠟，滴加50 μL無DNase蛋白酶K(20 μg/mL)，放入37 ℃恒溫箱中孵育30 min，PBS清洗3次，各5 min；加入50 μL的TUNEL檢測儀，放入37 ℃恒溫箱中孵育60 min，PBS清洗3次，各5 min；使用抗熒光淬滅封片液在顯微鏡下進(jìn)行觀察，計算TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 RT-PCR檢測凋亡相關(guān)因子表達(dá) 取各組大鼠腦組織徹底勻漿，加入1 mL Trizol溶液，設(shè)置離心機(jī)參數(shù)為4 ℃、12 000 rpm，離心5 min；取上清，加入300 μL氯仿，室溫靜置5 min，4 ℃、12 000 rpm條件下離心15 min；取上清，加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 rpm條件下離心10 min；棄上清，留下白色沉淀，加入1 mL的75%的乙醇洗滌沉淀，4 ℃、12 000 rpm條件下離心5 min，棄上清，風(fēng)干沉淀；加入20 μL的DEPC水，得到RNA樣品，于酶標(biāo)儀上測定260/280比值；反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃，5 min，預(yù)變性；95 ℃，15 s，變性，60 ℃，30 s，延伸，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，運用2-ΔΔCt法計算各組大鼠凋亡相關(guān)因子mRNA相對表達(dá)量。各引物序列如下，GAPDH：上游引物5’-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3’，下游引物5’-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3’，擴(kuò)增片段大小為204bp；Bcl2：上游引物5’-AGG ATT GTG GCC TTC TTT GA-3’，下游引物5’-CAG ATG CCG GTT CAG GTA CT-3’，擴(kuò)增片段大小為171bp；Bax：上游引物5’-GCT GGA CAC TGG ACT TCC TC-3’，下游引物5’-ACT CCA GCC ACA AAG ATG GT-3’，擴(kuò)增片段大小為bp195；caspase3：上游引物5’-TGC CAG AAG ATA CCA GTG GA-3’，下游引物5’-TGA CTG GAT GAA CCA TGA CC-3’，擴(kuò)增片段大小為228 bp。

1.3.6 Western blot檢測凋亡相關(guān)因子和PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達(dá) 取各組大鼠腦組織徹底勻漿，加入組織裂解緩沖液裂解組織，設(shè)置離心機(jī)參數(shù)為4 ℃、15 000 rpm，離心15 min，提取各組大鼠腦組織總蛋白，并采用BCA法測定腦組織蛋白濃度；進(jìn)行Western blot蛋白檢測，配制分離膠和濃縮膠，開始電泳，根據(jù)蛋白大小切取相應(yīng)的膠，并裁剪相應(yīng)大小的PVDF膜，以三明治方式組裝，采用100 V、90 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，加入用抗體稀釋液稀釋過的一抗[Bcl2(1∶500)、Bax(1∶500)、caspase3(1∶500)、PI3K(1∶500)、AKT(1∶500)、mTOR(1∶2 000)、p-PI3K(1∶500)、p-AKT(1∶500)、p-mTOR(1∶4 000)、GAPDH(1∶1 000)]置于4 ℃孵育過夜、加入用抗體稀釋液稀釋過的二抗[HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶2 000)]置于室溫雜交90 min，向膜上滴加適量ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色，于曝光儀中成像，并使用Image J軟件分析所掃描的圖像，具體操作步驟為：將所得條帶圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖像，再將條帶變成亮色，背景變成暗區(qū)，沿目標(biāo)條帶邊緣畫線，并將目標(biāo)條帶圈起，重復(fù)3次，取3次平均數(shù)，進(jìn)而得到目標(biāo)條帶的平均灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 蒿本內(nèi)酯對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)行為學(xué)的影響

假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞無損傷，未見明顯神經(jīng)行為學(xué)異常，神經(jīng)行為學(xué)評分為0分，蒿本內(nèi)酯組神經(jīng)行為學(xué)評分[(1.36±0.27)分]低于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組[(3.48±0.41)分、(2.99±0.30)分](t=13.656，P<0.001；t=12.771，P<0.001)。見圖1。

2.2 蒿本內(nèi)酯對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦梗死體積的影響

TTC染色顯示，蒿本內(nèi)酯組腦梗死體積比值[(15.96±2.01)%]低于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組[(47.53±3.48)%、(42.68±3.67)%](t=24.842，P<0.001；t=20.193，P<0.001)。見圖2。

2.3 蒿本內(nèi)酯對大鼠腦缺血再灌注損傷后細(xì)胞凋亡的影響

光鏡下可見模型組有大量TUNEL陽性細(xì)胞，細(xì)胞核呈棕黃色，核細(xì)胞固縮，蒿本內(nèi)酯組大鼠海馬半缺血區(qū)細(xì)胞凋亡明顯改善，其陽性細(xì)胞數(shù)低于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組(t=17.287，P<0.001；t=14.093，P<0.001)。見圖3。

2.4 蒿本內(nèi)酯對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，蒿本內(nèi)酯組大鼠腦組織中凋亡相關(guān)因子Bcl2mRNA水平高于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組(t=4.824，P<0.001；t=3.239，P=0.005)，Bax、caspase3 mRNA水平低于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組(t=28.315，P<0.001；t=23.973，P<0.001；t=30.631，P<0.001；t=38.625，P<0.001)；Western blot結(jié)果顯示，蒿本內(nèi)酯組大鼠腦組織中凋亡相關(guān)因子Bcl2蛋白表達(dá)高于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組(t=14.406，P<0.001；t=10.304，P<0.001)，Bax、caspase3蛋白表達(dá)低于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組(t=6.667，P<0.001；t=7.060，P<0.001；t=13.739，P<0.001；t=13.953，P<0.001)。見圖4。

2.5 蒿本內(nèi)酯對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織中PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，蒿本內(nèi)酯組大鼠腦組織中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)高于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組(t=12.067，P<0.001；t=11.315，P<0.001；t=14.977，P<0.001；t=17.834，P<0.001；t=6.396，P<0.001；t=5.918，P<0.001)。見圖5。

3 討論

缺血性腦血管病是一種由腦血管血流不足引起的疾病，是一種致殘性和致命性的疾病，男性死亡率高于女性[9]。在缺血性腦血管病的治療中，缺血區(qū)域血流重建或血供增強(qiáng)是缺血性腦組織修復(fù)的關(guān)鍵，但同時也存在再灌注損傷的問題[10]。因此，迫切需要尋找新的治療方法以保護(hù)患者神經(jīng)功能，改善缺血性腦血管病患者預(yù)后。不斷有研究從細(xì)胞和分子水平上闡明了腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，包括氧自由基的大量產(chǎn)生、炎癥損傷、自噬以及細(xì)胞凋亡等，這都將有助于尋找新的治療方法[11]。

蒿本內(nèi)酯是從中草藥當(dāng)歸和川芎中分離出來的生物活性成分，具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛功效，被廣泛用于治療心腦血管疾病[12]。有研究[13]顯示，蒿本內(nèi)酯可改善線粒體功能，恢復(fù)突觸結(jié)構(gòu)，改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠記憶功能障礙，可作為一種潛在的抗癡呆藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，蒿本內(nèi)酯可顯著改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分和腦梗死體積比值，表明蒿本內(nèi)酯對腦缺血再灌注損傷大鼠具有較好的保護(hù)作用。細(xì)胞凋亡是一種基因控制的自主細(xì)胞死亡過程，也稱為生理條件下的程序性細(xì)胞死亡，是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的機(jī)制之一[14]。Qian等[15]表明，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注后繼發(fā)性神經(jīng)元死亡的基本形式。本研究發(fā)現(xiàn)，蒿本內(nèi)酯組細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)低于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組，凋亡相關(guān)因子Bcl2 mRNA蛋白表達(dá)高于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組，Bax、caspase3 mRNA和蛋白表達(dá)低于模型組和蒿本內(nèi)酯+PI3K抑制劑LY294002組，表明蒿本內(nèi)酯可有效抑制腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)損傷。蒿本內(nèi)酯在腦缺血再灌注損傷中具有抗凋亡活性，抑制神經(jīng)元凋亡可能是蒿本內(nèi)酯保護(hù)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的機(jī)制之一。

PI3K/Akt/mTOR在信號通路中起著至關(guān)重要的作用，參與了細(xì)胞代謝、生長、增殖和存活的調(diào)控[16]。PI3K活化之后，可磷酸化下游Akt和p-Akt，激活mTOR，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、分化和遷移[17]。Zhu等[18]指出，PI3K/Akt/mTOR信號通路可對缺血缺氧性腦損傷患兒發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，蒿本內(nèi)酯處理后大鼠腦組織中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而予以PI3K抑制劑LY294002處理后，p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，表明蒿本內(nèi)酯對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路而抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。Tu等[19]也表明，PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活可發(fā)揮對腦缺血再灌注損傷原代海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用。同樣，Yu等[20]研究也顯示，提高Akt和mTOR磷酸化水平可抑制腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而使用LY294002阻斷PI3K后，可明顯降低Akt和mTOR磷酸化水平，降低PI3K的抗凋亡作用。李振等[7]認(rèn)為，蒿本內(nèi)酯可能是通過抑制NF-kB信號通路的激活而發(fā)揮對腦出血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。但蒿本內(nèi)酯對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制有待進(jìn)一步分析研究。

綜上所述，蒿本內(nèi)酯可有效改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)損傷，抑制大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用，該作用機(jī)制可能與激活PI3K/AKT/mTOR信號通路有關(guān)。蒿本內(nèi)酯可能會為腦缺血再灌注損傷的防治帶來全新方向，但蒿本內(nèi)酯對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制仍有待更多的體內(nèi)和體外實驗研究給予證明。