鄺玉慧，徐方飚，陳曉琦，戴璐璐，謝抗，陳欣菊

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000； 2.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091； 3.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510006

原發(fā)性肝癌大多數(shù)為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱“肝癌”)，占原發(fā)性肝癌85%[1]左右，是全球最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其較高的病死率嚴重威脅人們的健康和生命。大多數(shù)患者確診時已處于中晚期，失去了手術(shù)的機會，而靶向治療、介入治療及放化療的不良反應(yīng)會進一步加重肝臟負擔(dān)。中醫(yī)藥是中華民族文化的瑰寶，中醫(yī)藥防治腫瘤有自己獨特的特色和優(yōu)勢，在西醫(yī)治療手段的基礎(chǔ)上加強中醫(yī)藥療法，不僅能夠提高肝癌患者的生存率及生活質(zhì)量，而且能夠減輕放化療帶來的不良反應(yīng)，增強患者的免疫力。

菝葜為百合科植物菝葜(SmilaxchinaL) 的干燥根莖，又名金剛藤，2015年版《中華人民共和國藥典》記載菝葜具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀的功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，菝葜可以抑制腫瘤細胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，激活巨噬細胞和增強宿主免疫系統(tǒng)功能，臨床上也常用于治療腫瘤的組方中。菝葜具有多成分、多靶點、多途徑的相互作用特點，而目前對菝葜的研究多集中針對某一疾病的某一個作用機制，缺乏對其機制系統(tǒng)的研究。

虛擬篩選是利用計算機進行分子對接模擬，幫助篩選小分子藥物的一項技術(shù)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了系統(tǒng)生物學(xué)、信息網(wǎng)絡(luò)學(xué)和計算機科學(xué)，將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與網(wǎng)絡(luò)分析相結(jié)合，能夠系統(tǒng)預(yù)測和揭示藥物、化學(xué)成分、基因、靶點與疾病之間相互關(guān)系和作用機制。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和虛擬篩選[2]多層次構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型，是從整體的視角研究中醫(yī)藥，闡釋中藥有效性和科學(xué)性的新方式。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)預(yù)測菝葜抗肝癌的潛在作用靶點和通路，明確其作用途徑。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org)；疾病數(shù)據(jù)庫Genecard(https：//www.genecards.org/)、PharmDB-K數(shù)據(jù)庫(http：//pharmdb.org/)、GAD數(shù)據(jù)庫(https：//geneticassociationdb.nih.gov/)；數(shù)據(jù)分析軟件STRINGR(http：//string-db.org/cgi/input.pl)；基因本體 (gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析數(shù)據(jù)庫Bioconductor(http：//www.bioconductor.org/)；Cytoscape3.7.2(插件ClueGO、CluePedia、CytoNCA、MOCODE)、R軟件；分子對接模擬軟件AutoDockTools；分子結(jié)構(gòu)可視化及對接分析軟件Pymol。

1.2 菝葜活性成分與有效靶點的收集利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)數(shù)據(jù)庫，檢索“菝葜”的所有化學(xué)成分，并根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability，OB)值≥30%，類藥性(drug likeness，DL)值≥0.18為篩選條件收集主要活性成分，建立藥物化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫，搜索相應(yīng)的活性成分靶點并查閱近期文獻報道，補充未預(yù)測到活性成分的已知靶點，然后再通過Uniprot數(shù)據(jù)庫中的UniProKB檢索功能(https：//www.uniprot.org/)，通過輸入靶蛋白名稱，限定物種為“Homo sapiens”，再將得到的靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)化為基因ID，建立菝葜活性成分靶點數(shù)據(jù)庫。

1.3 肝癌靶點收集與PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建檢索關(guān)鍵詞“hepatocellular carcinoma”，限制物種為“homo sapiens”。對GeneCards、GAD和PharmDB-K數(shù)據(jù)庫收集的肝癌相關(guān)靶點基因，建立肝癌靶點數(shù)據(jù)庫。將肝癌靶點數(shù)據(jù)庫與菝葜活性成分靶點數(shù)據(jù)庫對比，提取相同靶基因構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，并上傳String平臺，限制物種為“homo sapiens”構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction networks，PPI)。然后導(dǎo)入Cytoscape3.7.2構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并采用CytoNCA對PPI網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，得到核心網(wǎng)絡(luò)。

1.4 肝癌靶點的功能富集分析利用R軟件ClusterProfiler包進行富集分析，限定物種為“homo sapiens”，檢驗值pvalueCutoff≤0.05，qvalueCutoff≤0.05，對關(guān)鍵靶點進行GO生物功能和KEGG富集分析。

1.5 活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接根據(jù)關(guān)鍵靶點對應(yīng)的成分，從中篩選出調(diào)控靶點最多的成分，通過Pubchem數(shù)據(jù)庫下載小分子化合物結(jié)構(gòu)，采用AutoDock軟件去水分子、氫等處理，運用Vina進行分子對接模擬獲取對接能量，pymol軟件對結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果

2.1 菝葜活性成分與有效靶點的收集本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到39個活性成分，共295個靶點。并根據(jù)DL和BL參數(shù)篩選13個有效活性成分并進行靶點預(yù)測，去除重復(fù)靶點后提取到112個有效靶點，通過Uniport數(shù)據(jù)庫進行基因ID轉(zhuǎn)換。

2.2 肝癌靶點收集通過關(guān)鍵詞“hepatocellular carcinoma”在GAD數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫、PharmDB-K數(shù)據(jù)庫檢索人的基因，共獲得7 525個肝癌相關(guān)疾病靶點。然后將所得的肝癌靶標基因與藥物有效靶點基因進行對比，映射出11個有效活性成分(見表1)，和53個關(guān)鍵靶點，即為菝葜治療肝癌潛在的靶標基因。構(gòu)建“活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)(見圖1)。

表1 菝葜有效活性成分及對應(yīng)靶點數(shù)

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析把共同靶標基因?qū)隨tring軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI(見圖2A)。調(diào)取得到的蛋白相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.2的插件CytoNCA根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中評價網(wǎng)絡(luò)節(jié)點重要性的核心參數(shù)度值(degree)進行拓撲分析(見圖2B)，degree越大，節(jié)點越大，顏色越深，說明節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越接近網(wǎng)絡(luò)中心位置PPI網(wǎng)絡(luò)，即有越多的成分作用于該靶點。根據(jù)靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中度值大于中位數(shù)2倍，即degree≥26為標準，得到7個核心靶點AKT1、VEGFA、CASP3、JUN、HSP90AA1、PPARG、RELA這些靶蛋白與肝癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

注：大紅色代表藥物菝葜，紫紅色代表藥物有效活性成分，湖藍色代表共同基因靶點圖1 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

注：A為蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI；B為CytoNCA拓撲分析圖2 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與拓樸分析圖

2.4 肝癌靶點的功能富集分析對靶點基因進行GO功能富集得到1 792個條目，其中生物學(xué)過程(biological process，BP)1 203個條目、細胞定位(cellular component，CC)34個條目、分子功能(molecular function，MF)53個條目。篩選排名前20個條目繪制氣泡圖(圖3A、3B、3C)。生物學(xué)過程BP主要表現(xiàn)在對脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激的反應(yīng)、類固醇激素的反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化的正調(diào)控、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等方面。KEGG通路富集分析得到129條信號通路并對前20個條目進行繪圖(如圖3D)，主要涉及癌癥通路、HIF-1信號通路、P53通路、VEGF通路及病毒感染通路等。如表2為前20名顯著差異通路及相關(guān)基因靶點數(shù)，利用Cytoscape構(gòu)建“通路-靶點”網(wǎng)絡(luò)(如圖4)，靶點所富集的通路越多，則該靶點所代表的長方形形狀越大，同理通路所含富集的靶點越多則該通路所代表的六邊形形狀越大。

注：A：GO-BP；B：GO-CC；圖3C-MF；3：D-KEGG通路富集圖3 肝癌靶點功能富集分析圖

表2 KEGG富集分析前20個相關(guān)通路

圖4 前20位相關(guān)條KEGG靶點-通路圖

2.5 活性成分與關(guān)鍵靶點分子對接通過ADME原則篩選的11個活性成分為β-谷甾醇、谷甾醇、山柰酚、偽原薯蕷皂苷、異黃杞苷、黃杞苷、(2R，3S)-2-(3，5-二羥基苯基)色烷-3，5，7-三醇、落新婦苷、紫杉葉素、順-二氫槲皮素、薯蕷皂苷元。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取11個活性成分mol2結(jié)構(gòu)，PDB數(shù)據(jù)庫獲取7個核心靶點結(jié)構(gòu)，對應(yīng)PDB ID為：AKT1(ID：6s9w)、VEGFA(ID：1mkk)、CASP3(ID：3v3k)、JUN(ID：5t01)、HSP90AA1(ID：6gr5)、PPARG(ID：6ms7)和RELA(ID：2o61)。利用AutoDock去除蛋白自身配體和去氫、去水分子處理，通過Vina進行配體與分子對接模擬，結(jié)合力熱圖(見圖5)。根據(jù)以上結(jié)果，選擇靶點數(shù)目靠前的兩個活性成分β-谷甾醇(beta-sitosterol)和山柰酚(Kaempferid)與圖4中度值最高的靶點AKT1和CASP9，通過Pymol顯示對接結(jié)構(gòu)，β-谷甾醇和山柰酚分別可以穩(wěn)定地對接到AKT1和CASP9蛋白結(jié)構(gòu)中(見圖6)。

圖5 分子對接結(jié)合力熱圖

注：A：CASP9與β-谷甾醇；B：CASP9與山柰酚；C：AKT1與β-谷甾醇；D：AKT1與山柰酚圖6 分子對接結(jié)構(gòu)圖

3 討論

從TCMSP數(shù)據(jù)庫得到11個活性化學(xué)成分和7個核心靶點，菝葜抗肝癌的核心靶點有AKT1、VEGFA、CASP3、JUN、HSP90AA1、PPARG、RELA等；主要是通過抗腫瘤血管生成、抑制肝癌細胞的增殖、促進肝癌細胞的凋亡和調(diào)控細胞周期等多靶點、多通路的抗肝癌方式。并根據(jù)虛擬篩選，發(fā)現(xiàn)11個活性成分與7個核心靶點對接結(jié)合能均較好，是菝葜發(fā)揮抗肝癌作用的重要化學(xué)成分，此外其與7個核心靶點均具有較好的結(jié)合能力。若結(jié)合能<0 kcal·mol-1，說明配體與受體可以進行自發(fā)結(jié)合，若結(jié)合能<-5.0 kcal·mol-1，說明兩者具有較好的結(jié)合性。從分子對接熱圖中可以直觀看到，11個活性成分均與7個核心靶點結(jié)合能均<-5.0 kcal·mol-1，這說明具有良好的結(jié)合力。

進一步研究菝葜抗GO生物過程和KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，菝葜抗肝癌靶點的生物過程涉及對脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、凋亡信號通路的調(diào)節(jié)、蛋白磷酸化的正調(diào)控、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等方面，這些通路即菝葜重要靶標抗肝癌的主要生物學(xué)過程。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出菝葜抗肝癌的主要活性成分β-谷甾醇、山柰酚和薯蕷皂苷元等與臨床研究報道[3-4]基本一致。臨床藥理研究發(fā)現(xiàn)，菝葜有抗炎鎮(zhèn)痛[5]、抗腫瘤[6]、抗氧化[7]、抑菌[8]、調(diào)節(jié)免疫體[9]、降血糖[10]等功能。有研究發(fā)現(xiàn)，菝葜可能增加PI3K/Akt依賴性eNOS磷酸化內(nèi)皮細胞中NO的產(chǎn)生與降低VEGF和NOS水平有關(guān)，從而誘導(dǎo)血管舒張，抑制腫瘤血管的新生[11-12]。同時菝葜使腫瘤細胞停滯在G2/M期，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，可能與激活CASP3，抑制NF-κB和下調(diào)Bcl-2和AKT有關(guān)[13]。

MAPK14是MAPK家族中的一員，被稱為腫瘤抑制因子，與腫瘤和炎癥的發(fā)生密切相關(guān)[14]。熱休克蛋白90(HSP90)作為腫瘤蛋白起著調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)構(gòu)象，穩(wěn)定和降解的作用[15]。VEGF是刺激血管生成的主要因子，在多數(shù)腫瘤中表達上調(diào)。VEGF/VEGFR2通路可能與高表達HSP90AA1/HSPA8患者的HCC復(fù)發(fā)有關(guān)[16]。目前己發(fā)現(xiàn)的Caspase(CASP)的家族成員具有傳遞凋亡信號作用，在維持其致瘤性和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[17]。AKT是一種蘇氨酸蛋白激酶[18-19]，其家族成員主要有3個，分別是AKT1、AKT2和AKT3這3個成員結(jié)構(gòu)類似，激活PI3K/Akt信號通路能夠促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

薯蕷皂苷元(diosgenin，DG)除有抗腫瘤外，還具有保肝、抗病毒、抗氧化、抗炎及降血脂等藥理活性[20-22]。王華等[23]發(fā)現(xiàn)DG能夠顯著影響丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，從細胞代謝組學(xué)方面驗證了DG抗腫瘤的作用。DG可能通過抑制對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的CYP2E1的活化，上調(diào)Bcl-2和Bid的蛋白表達，下調(diào)Bax和p53的蛋白表達，減輕對乙酰氨基酚導(dǎo)致的肝毒性[24]。通過抑制STAT3蛋白，進而抑制VEGF表達，抑制血管新生[25]。β-谷甾醇(Beta-Sitosterol，BS)通過細胞周期停滯和凋亡誘導(dǎo)作用在肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌中具有抗腫瘤活性，具有抗癌特性的無毒類化合物[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)山柰酚下調(diào)ERK磷酸化以及NFκB和cMyc表達，上調(diào)p21表達，抑制VEGF的分泌，證明其具有抑制血管新生的作用[28]。KF能促進的含氧自由基進而激活磷酸化p53和磷酸化ATM，刺激死亡受體4和死亡受體5，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[29]。Yang等[30]研究發(fā)現(xiàn)KF抑制MEK/ERK和STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以及激活線粒體凋亡通路，促進腫瘤細胞死亡。張帆等[31]發(fā)現(xiàn)KF通過激活凋亡經(jīng)典通路中的NLRP3和CASP1，從而促進NLRP3炎性小體的組裝來誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡。KF可能通過下調(diào)Bcl-2，并上調(diào)Bax、CASP3和CASP9，促進PARP的裂解，下調(diào)磷酸化的AKT、TIMP2和MMP2，抑制胃癌(astric cancer，GC)細胞和膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)細胞的增殖[32-33]。這與臨床研究發(fā)現(xiàn)的通過MAPK、PI3K/AKT、CASP、JAK-STAT等信號通路，抑制肝癌細胞增殖和凋亡，以及通過PI3K/AKT通路促進肝癌細胞自噬基本一致[34-35]。

綜上所述，本研究中所預(yù)測的菝葜主要活性成分及抗肝癌靶點與臨床結(jié)果基本一致。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子生物學(xué)等發(fā)展，中藥抗肝癌機制研究已深入分子基因?qū)用?。目前臨床關(guān)于菝葜中有效活性成分及作用機制的研究與本研究所預(yù)測結(jié)果基本一致。本研究初步分析了菝葜抗肝癌的活性成分及相關(guān)的信號通路和生物過程，為菝葜抗肝癌的藥理活性、靶點研究及作用機制提供了一定的理論支持，為以后藥理實驗的研究提供了方向。肝癌的發(fā)生與發(fā)展涉及多個基因和多個通絡(luò)，然而肝癌細胞信號通路復(fù)雜，一些菝葜活性成分及其作用機制尚未進行深入研究，因此可以在本研究的基礎(chǔ)上進一步研究菝葜抗肝癌的分子作用機制。