廖兆民 蔡俊，2，3 林建國 杜馨 王常高

（1. 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068；2. 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068； 3. 湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430068）

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，E.C.1.1.3.4，GOD）是一種非常重要的黃素糖蛋白，屬于氧化還原酶，在有氧條件下能專一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2［1］。GOD的應(yīng)用十分廣泛，在醫(yī)藥行業(yè)，GOD常應(yīng)用于生物傳感器和固定化酶［2］。GOD的反應(yīng)產(chǎn)物過氧化氫在食品領(lǐng)域可作為抗菌劑和氧化劑［3］，葡萄糖酸也可以作為色素穩(wěn)定劑、酸化劑和螯合劑等［4］。另外，飼料中添加GOD能促進(jìn)仔豬的生長和發(fā)育［5］。

葡萄糖氧化酶廣泛分布于動植物和微生物體內(nèi)，但目前工業(yè)上生產(chǎn)葡萄糖氧化酶的主要菌株為點(diǎn)青霉和黑曲霉［6］。霉菌GOD具有廣譜應(yīng)用的特點(diǎn)，能讓GOD在更高溫度和更長時間內(nèi)保持穩(wěn)定，從而提高經(jīng)濟(jì)效益［7］。盡管已經(jīng)有許多成功的研究通過使用遺傳修飾和其他方法來優(yōu)化霉菌GOD的產(chǎn)生，但是不同霉菌GOD積累的機(jī)制尚不完全清楚，且霉菌發(fā)酵生產(chǎn)GOD的過程中存在產(chǎn)生真菌毒素、發(fā)酵副產(chǎn)物較多等不利于后期分離GOD的缺點(diǎn)［8］。

異源表達(dá)重組GOD能有效解決以上問題［9］。特別是以畢赤酵母為宿主細(xì)胞構(gòu)建工程菌，具有蛋白表達(dá)量高、發(fā)酵成本低和便于分離純化等優(yōu)點(diǎn)，并且可以選擇含醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）強(qiáng)啟動子的質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)載體構(gòu)建［10］，同時重組酵母細(xì)胞可進(jìn)行高密度連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵，有效控制外源基因的表達(dá)［11］。

本研究通過多序列比對設(shè)計簡并引物，從黑曲霉中克隆得到GOD，并將其構(gòu)建在pPICZαA載體上，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115，實(shí)現(xiàn)了黑曲霉GOD的異源表達(dá)；以重組酵母為研究對象，系統(tǒng)優(yōu)化誘導(dǎo)溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速和甲醇濃度等，實(shí)現(xiàn)了重組GOD的高效表達(dá)；在30 L發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵放大試驗(yàn)，通過共表達(dá)His4，采用DO-STAT的甲醇流加策略高密度發(fā)酵，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了葡萄糖氧化酶的高效表達(dá)，為葡萄糖氧化酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 黑曲霉（Aspergillus niger）菌株由湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院微生物制劑研究團(tuán)隊(duì)保藏。大腸桿菌（Escherichia coli）Top10菌株購自天根生化科技有限公司。畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115由武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院楊江科教授饋贈。畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA購自淼靈生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶Kpn I、Not I、Pme I為NEB公司產(chǎn)品；葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶、鄰聯(lián)茴香胺、牛血清白蛋白購自Sigma公司；真菌提取試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；高保真DNA聚合酶、DNA Marker、蛋白Marker，質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA片段純化試劑盒等購于TaKaRa公司；pGM-Simple-T Fast克隆試劑盒購于天根生化科技有限公司；其他分析純試劑購自國藥集團(tuán)；PCR擴(kuò)增引物由南京金斯瑞公司合成。

1.1.3 培養(yǎng)基 黑曲霉的培養(yǎng)用PDA培養(yǎng)基。大腸桿菌的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化用LB培養(yǎng)基和低鹽LB培養(yǎng)基。酵母的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化和蛋白的誘導(dǎo)產(chǎn)生用YPD、BMGY、BMMY等培養(yǎng)基。分批發(fā)酵用BSM培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基組分成分（1 L）：PDA：馬鈴薯200 g和葡萄糖20 g。LB：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g和NaCl 10 g。低鹽LB：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g和NaCl 5 g。YPD：蛋白胨20 g、酵母粉10 g和葡萄糖20 g。BMGY：蛋白胨20 g、酵母粉10 g、pH 6.0磷酸鉀緩沖液100 mmol/L、YNB 13.4 g、甘油10 g和生物素 400 μg。BMMY：蛋白胨20 g、酵母粉10 g、pH 6.0磷酸鉀緩沖液100 mmol/L、YNB 13.4 g、甲醇5 g和生物素400 μg。BSM：80% H3PO426.7 mL、CaSO40.93 g、K2SO418.2 g、MgSO4·7H2O 14.9 g、KOH 4.13 g、甘油40 g和PTM1 4.35 mL。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：含12 mL/L PTM1的50%（W/W）甘油和2 g/L L-組氨酸。誘導(dǎo)培養(yǎng)基：含12 mL/L PTM1的甲醇。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉全基因組的提取 按照索萊寶科技有限公司真菌基因組提取試劑盒方法提取黑曲霉基因組DNA。

1.2.2 簡并引物的設(shè)計 在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載多個有活性的黑曲霉葡萄糖氧化酶基因序列，13個NCBI序 列 號 分 別 為：AJ294936.1、AY803992.1、 DQ661005.1、DQ836361.1、EU532181.1、EU532182.1、FJ979866.1、HQ269422.1、J05242.1、JX105360.1、KC333175.1、KJ774107.1和X16061.1。通過分析其氨基酸序列設(shè)計簡并引物，其5′端引物序列Z1為：5′-ATGCARACTCTKKTTGTGAG-3′，其3′端 引 物 序列Z2為：5′-TCACTGCATRGAAGCATAAT-3′。

1.2.3 葡萄糖氧化酶基因的擴(kuò)增 簡并引物以黑曲霉全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系為 50 μL：10×PCR buffer（含Mg2+）5.0 μL、Z1（10 μmol/L） 1.5 μL、Z2（10 μmol/L）1.5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）4.0 μL、模板DNA 1.0 μL、rTaq酶 1 μL和ddH2O 36 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 4 min，共30個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。將回收產(chǎn)物與T載體連接，對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序。

1.2.4 GOD基因重組表達(dá)載體的構(gòu)建 為了確保分泌表達(dá)的GOD的N端帶有天然的氨基酸殘基，在上游引物5′端引入了表達(dá)載體pPICZαA的α-factor信號肽中Xho I酶切位點(diǎn)序列（下劃線部分）和Kex 2信號肽酶切位點(diǎn)序列（斜體部分），并去掉GOD ORF中的信號肽序列，下游引物5′端引入了Not I酶切位點(diǎn)序列（下劃線部分）。引物序列為：GOD-F：5′-CCCTCGAGAAAAGAAGCAATGGCATCGA AGC-3′，GOD-R：5′-TTGCGGCCGCCTGCATGGAAGC TAAT-3′，PCR反應(yīng)體系和條件同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后用限制性核酸內(nèi)切酶Xho I和Not I雙酶切，與同樣雙酶切后的表達(dá)載體pPICZαA進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到E.coli Top10。酶切鑒定陽性克隆，并送至北京擎科生物有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及搖瓶水平誘導(dǎo)培養(yǎng) 將重組質(zhì)粒pPICZαA-GOD經(jīng)Pme I酶切線性化，用DNA片段純化試劑盒回收至高純度的DNA。將5-10 μg線性化的pPICZαA-GOD質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化至80 μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPD平板上，30℃避光靜置培養(yǎng)2-3 d，用無菌牙簽挑取陽性轉(zhuǎn)化子依次點(diǎn)種到含有500、1 000和2 000 μg/mL Zeocin的YPD平板上，30℃避光靜置培養(yǎng)2-3 d，觀察酵母轉(zhuǎn)化子的生長情況，逐級篩選含有多拷貝目的基因的重組酵母菌株。挑選6株含多拷貝目的基因的重組酵母菌株轉(zhuǎn)接至YPD液體培養(yǎng)基（50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶）中，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液按1%的接種量接種到BMGY液體培養(yǎng)基中（25 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶中），于30℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16-18 h，OD600=4-6，離心收集全部菌體，用BMMY液體培養(yǎng)基（50 mL培養(yǎng)基/500 mL三角瓶中）重懸菌體，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h，每24 h補(bǔ)加發(fā)酵液體積0.5%的甲醇，將GOD表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)化子命名為GS115/pPICZαAGOD。

1.2.6 葡萄糖氧化酶活力測定 采用鄰聯(lián)茴香胺分光光度法［12］。在7 mL離心管中，加入鄰聯(lián)茴香胺緩沖溶液2.5 mL，18%葡萄糖溶液0.3 mL，100 U/mg辣根過氧化酶溶液0.1 mL，混勻，37℃預(yù)熱3 min，分別加入0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 U/mL葡萄糖氧化酶標(biāo)準(zhǔn)液，37℃反應(yīng)3 min，加入2 mL 2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，于540 nm測定吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)酵上清液經(jīng)稀釋后測定540 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計算發(fā)酵上清液葡萄糖氧化酶活力。酶活力定義為：在溫度為37℃，pH為6.0的磷酸鈉緩沖溶液的反應(yīng)條件下，每分鐘將1 μmol/L的葡萄糖催化氧化為葡萄糖酸和過氧化氫所需要的GOD的量為一個GOD的活力單位。

1.2.7 共表達(dá)載體pPIC9k的轉(zhuǎn)化 由于重組酵母為組氨酸缺陷型菌株，將pPIC9k經(jīng)BspE I酶切線性化后電轉(zhuǎn)至重組酵母GS115/pPICZαA-GOD，挑取陽性轉(zhuǎn)化子命名為GS115/pPICZαA-GOD/His4在搖瓶水平進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)條件同1.2.5。

1.2.8 搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化 為了探究搖瓶中重組畢赤酵母產(chǎn)GOD最佳條件，通過對誘導(dǎo)過程中的溫度、pH、甲醇體積分?jǐn)?shù)和搖床轉(zhuǎn)速等4個因素進(jìn)行了優(yōu)化。挑取酶活最高的多拷貝酵母轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至YPD培養(yǎng)基中，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液按1%的接種量接種到BMGY液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)16-18 h，OD600=2-6，離心收集全部菌體，用BMMY液體培養(yǎng)基重懸菌體，于30℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h，每24 h補(bǔ)加發(fā)酵液體積0.5%的甲醇。誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置為15℃、20℃、25℃、30℃和35℃；pH分別設(shè)置為4、5、6、7和8；甲醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%；搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為160、190、220、250和 280 r/min。誘導(dǎo)96 h后測定OD600和酶活來確定最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.9 GS115/pPICZαA-GOD的高密度發(fā)酵 選取搖床水平上酶活最高的轉(zhuǎn)化子，研究其在30 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵產(chǎn)酶過程。挑取平板上的單菌落接種于YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，按3%接種量轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基（100 mL培養(yǎng)基/500 mL三角瓶中）至OD600≈10接種于含10 L BSM培養(yǎng)基（含2 g/L組氨酸）的30 L發(fā)酵罐，接種量為10%。誘導(dǎo)前用濃氨水控制pH 5.0，培養(yǎng)溫度控制在30℃。發(fā)酵過程分為3個階段，第一階段為甘油分批階段，酵母細(xì)胞消耗底水培養(yǎng)基積累菌體。底水培養(yǎng)基中甘油耗盡時（DO值陡升）進(jìn)入甘油流加階段，開始流加50%甘油和2 g/L組氨酸，至生物量達(dá)到約180-220 g/L，停止流加甘油和組氨酸，1 h后發(fā)酵液中甘油耗盡（溶氧值DO陡升）進(jìn)入誘導(dǎo)階段，開始流加甲醇，每12 h取樣測定發(fā)酵上清液酶活和細(xì)胞濕重，并進(jìn)行SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色液（乙醇150 mL、冰醋酸50 mL和水800 mL）脫色。1.2.10 GS115/pPICZαA-GOD/His4的高密度發(fā)酵 按3%接種量轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基（100 mL培養(yǎng)基/ 500 mL三角瓶中）至OD600≈10接種于含10 L BSM培養(yǎng)基的30 L發(fā)酵罐，接種量為10%。誘導(dǎo)前用濃氨水控制pH 5.0，培養(yǎng)溫度控制在30℃。底水培養(yǎng)基中甘油耗盡時開始流加50%甘油至23 h，停止流加甘油，饑餓培養(yǎng)1 h開始流加甲醇，甲醇流加方式采用低甲醇高溶氧的DO-STAT流加策略，通過降低甲醇流加速度使溶氧維持在10%左右，每12 h取樣測定發(fā)酵上清液酶活和細(xì)胞濕重。

2 結(jié)果

2.1 多序列對比和黑曲霉GOD的克隆分析

多序列比對結(jié)果如圖1，以黑曲霉全基因組DNA為模板（圖2），簡并引物Z1和Z2進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖3）。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，該GODDNA長1 818 bp，GC含量為58%，無內(nèi)含子，編碼606個氨基酸。通過同源分析，與黑曲霉Z-25的GOD（GenBank登錄號：FJ979866.1）有100%的核酸序列相似性。去除信號肽的GOD的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4。

圖1 部分黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶氨基酸序列比對Fig.1 Alignment of glucose oxidase amino acid sequences from partial A. niger

圖2 黑曲霉全基因組的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of whole genome extraction from Aspergillus niger

圖3 簡并引物Z1、Z2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of degenerate primers Z1 and Z2

圖4 葡萄糖氧化酶的PCR擴(kuò)增Fig.4 PCR amplification of glucose oxidase

2.2 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

將重組質(zhì)粒pPICZαA-GOD（圖5-A）轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌Top10，并在含Zeocin的低鹽LB平板上篩選陽性菌落。提取陽性菌落質(zhì)粒，經(jīng)Xho I和Not I雙酶切后，得到約3.5和1.8 kb的2個DNA片段，亦與預(yù)期大小相符（圖5-B）。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示去除信號肽的GOD已正確插入到pPICZαA載體α-因子信號肽序列的下游，表明含黑曲霉GOD的畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA-GOD構(gòu)建成功。

圖5 重組質(zhì)粒pPICZαA-GOD構(gòu)建及雙酶切鑒定Fig.5 Construction of recombinant plasmid pPICZαAGOD and identification by double restriction endonuclease digestion

2.3 多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選

根據(jù)黑曲霉GOD基因序列的限制性酶切圖譜，選擇限制性內(nèi)切酶Pme I對重組質(zhì)粒pPICZαAGOD進(jìn)行線性化（圖6），遷移速度較慢的為線性化的pPICZαA-GOD片段。同時，用Pme I對空載體pPICZαA進(jìn)行線性化處理，作為后續(xù)試驗(yàn)的陰性對照。將線性化的重組質(zhì)粒pPICZαA-GOD和空質(zhì)粒pPICZαA電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)。在YPD平板生長3 d后，用無菌牙簽挑取單菌落依次點(diǎn)種在含有Zeocin濃度分別為500、1 000和2 000 μg/mL的YPD平板上。2 d后，酵母陽性轉(zhuǎn)化子在YPD抗性梯度平板上的生長情況如圖7所示，挑取6株在含Zeocin 2 000 μg/mL的YPD平板上生長較好的重組酵母單菌落，進(jìn)行下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。

圖6 pPICZαA-GOD和pPICZαA線性化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of the linearized products of pPICZαA-GOD and pPICZαA

圖7 酵母轉(zhuǎn)化子的高濃度zeocin抗性篩選Fig.7 Screening of high concentration zeocin resistance of yeast transformants

2.4 GOD在畢赤酵母GS115中的表達(dá)

將上述6株重組酵母菌分別命名為A1、A2、A3、A4、A5和A6，在BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，每24 h取樣測定發(fā)酵上清液中葡萄糖氧化酶活力。圖8為6株重組酵母菌誘導(dǎo)培養(yǎng)96 h的產(chǎn)酶曲線圖。隨著誘導(dǎo)時間的延長，發(fā)酵上清液中葡萄糖氧化酶活力不斷增加。其中，重組酵母菌A6產(chǎn)葡萄糖氧化酶的能力最佳，甲醇誘導(dǎo)96 h時，發(fā)酵上清液中葡萄糖氧化酶的活力達(dá)到32.25 U/mL。因此，將重組酵母菌A6命名為GS115/pPICZαA-GOD，用于后續(xù)試驗(yàn)的研究。

圖8 高zeocin抗性酵母轉(zhuǎn)化子表達(dá)葡萄糖氧化酶的活力曲線Fig.8 Activity curve of glucose oxidase expressed by transformants with high zeocin resistance in yeast

通過共表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k，在重組酵母細(xì)胞中共表達(dá)His4，如圖9-A重組酵母GS115/pPICZαAGOD/His4甲醇誘導(dǎo)96 h后，GOD表達(dá)量相比原始重組酵母提高了11%。同時，OD600相比原始重組酵母提高了65%，說明通過共表達(dá)His4補(bǔ)償畢赤酵母GS115為組氨酸缺陷型菌株的不足，使得細(xì)胞密度大幅度提升從而提高了重組GOD表達(dá)量。

圖9 GS115/pPICZαA-GOD與GS115/pPICZαA-GOD/His4的搖瓶水平誘導(dǎo)結(jié)果Fig.9 GS115/pPICZαA-GOD and GS115/pPICZαA-GOD/His4 shake flask level induction results

2.5 重組酵母產(chǎn)GOD的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

通過對誘導(dǎo)溫度、pH、甲醇體積分?jǐn)?shù)和搖床轉(zhuǎn)速等4個因素進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，如圖10-A，誘導(dǎo)溫度對重組酵母生長和GOD表達(dá)量均有較大的影響。15-25℃酵母生長情況差別不大，但重組GOD表達(dá)量卻有較大差異，15℃時GOD表達(dá)量為10.7 U/mL，隨著誘導(dǎo)溫度升高，生物量和表達(dá)量均上升。30℃時，GOD酶活達(dá)到最高31.05 U/mL，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，GOD活性開始下降，這可能是由于畢赤酵母在高于30℃的條件下不利于蛋白質(zhì)的表達(dá)。pH對誘導(dǎo)過程中細(xì)胞生長影響不大，當(dāng)pH6時，GOD酶活最高為36.5 U/mL（圖10-B）。甲醇體積分?jǐn)?shù)對重組酵母產(chǎn)GOD的影響如圖10-C，用1.0%甲醇進(jìn)

行誘導(dǎo)時，獲得的酶活最高為45.2 U/mL，但隨著甲醇濃度的升高，細(xì)胞密度和酶活力顯著降低。搖床通過不同轉(zhuǎn)速的振蕩影響培養(yǎng)基中的溶氧值從而影響細(xì)胞生長和目的蛋白的表達(dá)（圖10-D），當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到250 r/min時，細(xì)胞密度最大且此時重組GOD表達(dá)量最高。通過對重組酵母產(chǎn)GOD的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明最佳發(fā)酵條件為：在30℃、pH 6.0、250 r/min條件下誘導(dǎo)96 h，每24 h向發(fā)酵液中添加甲醇至終濃度為1.0%，重組GOD酶活達(dá)到50.1 U/mL，較優(yōu)化前提高了55.3%。

圖10 重組酵母產(chǎn)GOD發(fā)酵條件的優(yōu)化Fig.10 Optimization of fermentation conditions for GOD production by recombinant yeast

2.6 GS115/pPICZαA-GOD的高密度發(fā)酵

如圖11所示，發(fā)酵0-18 h，處于甘油分批階段，生物量增長至103 g/L。發(fā)酵18 h時監(jiān)測到DO值迅速上升，說明底水培養(yǎng)基中甘油耗盡，此時開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，進(jìn)入甘油流加階段。該階段重組酵母細(xì)胞不表達(dá)葡萄糖氧化酶蛋白，當(dāng)生物量達(dá)到180 g/L以上時，停止流加甘油和組氨酸。24 h時發(fā)酵液中甘油耗盡（溶氧值DO陡升），生物量達(dá)到183.5 g/L，此時開始流加甲醇誘導(dǎo)酵母細(xì)胞表達(dá)GOD，發(fā)酵液中GOD活性逐漸增加。發(fā)酵72 h時生物量開始下降，由于重組酵母細(xì)胞為組氨酸缺陷型菌株，此時生物量下降的原因很有可能是培養(yǎng)基中組氨酸已耗盡，部分菌體衰老自溶。隨著甲醇的持續(xù)誘導(dǎo)，發(fā)酵上清液中GOD活性繼續(xù)增加。發(fā)酵120 h（誘導(dǎo)96 h）時發(fā)酵液中GOD活性達(dá)到最高307 U/mL，相比搖床水平，酶活提高了5.1倍。SDS-PAGE結(jié)果（圖12）表明，發(fā)酵液中GOD蛋白表達(dá)量也在不斷積累，發(fā)酵上清中GOD純度非常高，僅含有少量的雜蛋白，有利于GOD的分離。

圖12 30 L發(fā)酵罐中重組畢赤酵母表達(dá)葡萄糖氧化酶蛋白的SDS-PAGEFig.12 SDS-PAGE of glucose oxidase protein expressed in recombinant P. pastoris in 30 L bioreactor

2.7 GS115/pPICZαA-GOD/His4的高密度發(fā)酵

如圖13，發(fā)酵0-18 h，處于甘油分批階段，細(xì)胞濕重增長至138 g/L。24 h時發(fā)酵液中甘油耗盡（溶氧值DO陡升），細(xì)胞濕重達(dá)到225.5 g/L，較重組酵母GS115/pPICZαA-GOD提高了22.9%。此時開始以低甲醇流速誘導(dǎo)酵母細(xì)胞表達(dá)GOD，采用DO-STAT控制培養(yǎng)，整個誘導(dǎo)階段溶氧控制10%左右，逐步提高轉(zhuǎn)速和通氣量。發(fā)酵108 h（誘導(dǎo)84 h）時細(xì)胞濕重達(dá)到最高440 g/L，相比GS115/pPICZαA-GOD提高了72.5%。發(fā)酵120 h時GOD活性達(dá)到最高461 U/mL，相比GS115/pPICZαA-GOD提高了50.2%。

圖13 重組畢赤酵母GS115/pPICZαA-GOD/His4的高密度發(fā)酵曲線Fig.13 High density fermentation curve of recombinant P. pastoris GS115/pPICZαA-GOD/His4

3 討論

葡萄糖氧化酶廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、紡織和飼料等領(lǐng)域［13-16］。目前，大多數(shù)研究旨在產(chǎn)葡萄糖氧化酶菌株的誘變育種和產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，也有部分研究通過基因工程的手段異源表達(dá)重組葡萄糖氧化酶基因［6］。畢赤酵母作為甲基營養(yǎng)型酵母特別適合外源蛋白的表達(dá)，更易于進(jìn)行基因操作，例如基因打靶、高頻DNA轉(zhuǎn)化、通過功能互補(bǔ)進(jìn)行克隆、在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外水平高效表達(dá)蛋白質(zhì)，以及執(zhí)行更高級別的真核蛋白質(zhì)修飾的能力，如糖基化、二硫鍵形成和蛋白水解處理［17］。即使在連續(xù)和大規(guī)模的工業(yè)化發(fā)酵過程中，畢赤酵母也可以用最簡單的培養(yǎng)基培養(yǎng)到非常高的細(xì)胞密度［18-19］，同時整合的載體有助于重組元件的遺傳穩(wěn)定性。由于畢赤酵母自身的天然蛋白分泌水平相對較低，因此重組分泌型蛋白的純化方式也更加簡單［20-21］。本研究依據(jù)已報道的多個黑曲霉葡萄糖氧化酶DNA序列設(shè)計簡并引物，從黑曲霉中成功克隆出GOD，通過BLAST，與黑曲霉Z-25的葡萄糖氧化酶基因（GenBank登錄號：FJ979866.1）相似性達(dá)100%。

本研究構(gòu)建的畢赤酵母工程菌株GS115/pPICZαA-GOD在30℃、220 r/min條件下0.5%甲醇誘導(dǎo)96 h酶活可達(dá)32.25 U/mL。適宜的誘導(dǎo)條件是高效表達(dá)重組蛋白的必要條件，經(jīng)優(yōu)化得到最佳誘導(dǎo)條件為：在30℃、pH 6.0、250 r/min條件下誘導(dǎo)96 h，每24 h向發(fā)酵液中添加甲醇至終濃度為1.0%，重組GOD酶活達(dá)到50.1 U/mL，提高了55.3%。甲醇濃度為0.5%時，細(xì)胞密度最大，但酶活卻不是最高，說明細(xì)胞密度越高并不一定代表蛋白表達(dá)量越高，誘導(dǎo)劑的濃度也是影響蛋白表達(dá)的重要因素之一。劉瑜等［22］報道在畢赤酵母SMD1168中表達(dá)黑曲霉QYW3221 GOD，甲醇誘導(dǎo)7 d后酶活最高達(dá)14.9 U/mL。周亞鳳等［23］報道在畢赤酵母GS115中表達(dá)黑曲霉9029 GOD，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)3-4 d，發(fā)酵液中GOD活力達(dá)30-40 U/mL。Crognale等［24］將變換青霉P16 GOD在畢赤酵母X-33中異源表達(dá)，在3 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵15 d后GOD活力達(dá)到50 U/mL。本研究在30 L發(fā)酵罐中誘導(dǎo)表達(dá)4 d，GOD酶活達(dá)到307.52 U/mL，是搖瓶水平的6.1倍，達(dá)到了目前研究中的較高水平，但由于重組酵母為組氨酸缺陷型菌株，若使用BSM培養(yǎng)基分批發(fā)酵則需要額外添加L-組氨酸，從工業(yè)化的角度來說，添加L-組氨酸大大增加了生產(chǎn)成本。

本研究通過共表達(dá)質(zhì)粒pPIC9k引入His4，搖瓶水平研究表明，共表達(dá)His4使重組酵母的生物量提高了65%，GOD活力提高了11%。本研究采用“低甲醇-高溶氧”的DO-STAT流加策略在30 L發(fā)酵罐中誘導(dǎo)96 h，GS115/pPICZαA-GOD/His4細(xì)胞濕重達(dá)到432.5 g/L。此時發(fā)酵上清液中GOD活力達(dá)到最高，為461 U/mL，較原始重組酵母提高了50.2%。根據(jù)葡萄糖氧化酶的DNA序列推測其分子量為64 kD，郭瑤等［25］報道黑曲霉Z-25所產(chǎn)GOD的分子量為76 kD，與推測的分子量相比多出的部分為糖基化部分，糖基化程度為15.8%。畢赤酵母會對重組GOD進(jìn)行高糖基化修飾［26］，本研究中重組GOD分子量約為90 kD，比黑曲霉Z-25所產(chǎn)GOD的分子量高約14%，這可能是過度糖基化造成的。GOD是一種糖蛋白，糖基化修飾是畢赤酵母中GOD正確折疊和裝配的重要過程。后續(xù)研究中將通過酶工程技術(shù)，共表達(dá)凝集素伴侶加快糖基化修飾過程，這可能是促進(jìn)畢赤酵母分泌表達(dá)GOD的有效策略。

4 結(jié)論

從黑曲霉中克隆獲得GOD，實(shí)現(xiàn)了黑曲霉GOD在畢赤酵母GS115中的高效表達(dá)，最佳發(fā)酵條件為重組畢赤酵母GS115/pPICZαA-GOD在30℃、pH 6.0、250 r/min使用1.0%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，GOD表達(dá)量相比優(yōu)化前提高55.3%。通過30 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵，相比搖瓶水平，酶活提高5.1倍，達(dá)到307.52 U/mL。首次在畢赤酵母GS115中共表達(dá)His4，并采用DOSTAT的甲醇流加策略在30 L發(fā)酵罐水平上實(shí)現(xiàn)了GOD的高效表達(dá)，大大提高了重組酵母細(xì)胞濕重和GOD酶活，最高酶活可達(dá)到461 U/mL，同時降低了發(fā)酵成本，避免了發(fā)酵過程中添加組氨酸。