常鳳霞，蔡 薇，巴曉麗，董 力，馬維蘭

1.青海省第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，青海西寧 810000；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，青海西寧 810001；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院急診內(nèi)科，青海西寧 810001

慢加急性肝衰竭(ACLF)是慢性肝病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，常見病因?yàn)椴《拘愿窝?，尤其以乙型肝炎居多，臨床稱之為乙型肝炎相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)[1]。這類患者的臨床表現(xiàn)包括腹水、黃疸、凝血障礙等，發(fā)病機(jī)制與多種因素如代謝、病毒、宿主等有關(guān)[2]。HBV-ACLF具有病情進(jìn)展快、病情嚴(yán)重等特點(diǎn)，容易誘發(fā)出血、感染、電解質(zhì)紊亂等并發(fā)癥，病死率較高[3]。既往大多通過檢測(cè)肝功能、血常規(guī)等血清生物學(xué)指標(biāo)評(píng)估肝損傷患者的病情，雖然以上方法具有一定價(jià)值，但干擾因素較多，如油膩食品、運(yùn)動(dòng)、熬夜等，可導(dǎo)致其缺乏特異性，且無法對(duì)預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。因此，臨床還需尋求更理想的指標(biāo)以進(jìn)一步了解ACLF的進(jìn)展機(jī)制，為預(yù)測(cè)預(yù)后提供依據(jù)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸(miRNA)與肝損傷發(fā)生有關(guān)，例如miR-125b-5p與慢性肝炎發(fā)病密切相關(guān)，隨著病情進(jìn)展，血清miR-125b-5p表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)[4]。另有研究提示，miR-146a-5p可經(jīng)負(fù)反饋對(duì)炎癥進(jìn)行抑制，能調(diào)節(jié)肝病患者的免疫功能[5]。由此可見，miR-125b-5p、miR-146a-5p可能均與肝損傷的進(jìn)展有關(guān)，但其對(duì)預(yù)后的影響機(jī)制尚不明確?；诖?，本研究通過分析血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表達(dá)水平與HBV-ACLF患者預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床HBV-ACLF的診治提供新思路，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入青海省第四人民醫(yī)院2016年7月至2019年7月收治的80例HBV-ACLF患者進(jìn)行前瞻性研究。其中男43例，女37例；年齡44～78歲，平均(60.02±12.53)歲；并發(fā)癥：消化道出血15例，肺部感染12例，腹膜炎13例，肝性腦病12例。HBV-ACLF的診斷參考《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[6]與《肝衰竭診治指南(2012年版)》[7]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：既往有慢性乙型肝炎病史，短期內(nèi)出現(xiàn)亞急性或急性肝功能失代償癥狀，包括(1)乏力、消化道表現(xiàn)(如惡心、嘔吐、腹痛、飽脹感等)；(2)黃疸加深，總膽紅素(TBil)每日升高超過17.1 μmol/L或升高超過正常范圍上限10倍；(3)伴出血傾向；(4)有或無肝性腦病；(5)腹水。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)滿足上述關(guān)于HBV-ACLF的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)入院后均行常規(guī)的肝功能、血常規(guī)以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查；(3)病歷資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)因其他肝病引起的ACLF者；(2)惡性腫瘤者；(3)腎、心等臟器嚴(yán)重受損者；(4)妊娠期女性；(5)自身免疫性肝病、酒精性/藥物性肝病者；(6)高血壓、糖尿病等病情控制欠佳者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，所有患者均自愿簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清miR-125b-5p、miR-146a-5p檢測(cè) 采集2 mL空腹肘靜脈血，存放于-20 ℃冰箱待測(cè)。(1)提取RNA：取Trizol 1 mL加入試管使細(xì)胞裂解，取氯仿200 μL加入，振蕩15 s，在室溫環(huán)境下反應(yīng)3 min，于4 ℃下以3 200 r/min離心15 min，吸取上層水相置于提前備好的離心管內(nèi)。取異丙醇加入試管，混合充分，在室溫下反應(yīng)10 min，再次在4 ℃下以3 200 r/min離心10 min，使RNA沉淀。棄上清液，75%乙醇對(duì)沉淀物洗滌2次，在室溫下反應(yīng)10 min，取無RNA酶水加入，促進(jìn)溶解，對(duì)RNA水平進(jìn)行調(diào)整。(2)行反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR測(cè)定，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)；95 ℃ 60 s；60 ℃ 60 s；70.0～98.5 ℃，每隔10 s升高0.5 ℃，58個(gè)循環(huán)；26 ℃ 10 s。將U6視作內(nèi)參基因，各基因引物序列分別如下：U6上游序列為5′-TGGAAAGGACGAAACACCGT-3′，下游序列為5′-ATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′[8]；miR-125b-5p上游序列為5′-ATTTGAGCTACAGCACGGTCGA-3′，下游序列為5′-GGCTAGTGAAGTTTACCCCCTGC-3′[9]；miR-146a-5p上游序列為5′-ACTGCAAGGAGGGGTCTTTG-3′，下游序列為5′-CAAGCCCACGATGACAGAGA-3′[10]。用2-ΔΔCt表示目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。待循環(huán)完畢，分析溶解曲線，檢測(cè)溫度控制為70～95 ℃。

1.2.2肝功能指標(biāo)檢測(cè) 另取空腹靜脈血2 mL，行離心處理，離心時(shí)間15 min，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心半徑10 cm，分離血清，存放在-20 ℃冰箱待測(cè)。經(jīng)全自動(dòng)生化分析儀(北京博科技術(shù)股份有限公司，BK-400)測(cè)定血清TBil、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、清蛋白(ALB)水平。

1.2.3其他指標(biāo)檢測(cè) 采用熒光定量PCR試劑盒(上海晅科生物科技有限公司)測(cè)定HBV-DNA，采用血細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，BC-5000)測(cè)定外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、中性粒細(xì)胞絕對(duì)值(NE)。采用全自動(dòng)生化分析儀(廠家、型號(hào)同上)測(cè)定血肌酐(Cr)水平，經(jīng)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法(試劑由廣州博康生物技術(shù)有限公司提供)測(cè)定凝血酶原時(shí)間(PT)，從而計(jì)算凝血酶原活動(dòng)度(PTA)。PTA=[對(duì)照PT-(對(duì)照PT×0.6)/患者PT-(對(duì)照PT×0.6)]×100%。

1.2.4隨訪 對(duì)所有患者進(jìn)行為期1年(從入院治療時(shí)起至1年后止)的隨訪，隨訪方式為門診復(fù)查或電話隨訪。

1.2.5生存、死亡亞組的分析比較 根據(jù)患者1年的預(yù)后情況，分成生存組、死亡組。比較兩組血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表達(dá)水平及其他血液指標(biāo)水平。

2 結(jié) 果

2.1生存資料概況 80例患者經(jīng)1年跟蹤隨訪，生存59例、死亡21例。病死率為26.25%。以各患者的生存時(shí)間建立的Kaplan-Meier生存曲線，見圖1。

圖1 80例HBV-ACLF患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.2兩組臨床資料比較 死亡組NE、TBil、AST、ALT水平以及消化道出血、肝性腦病占比高于生存組(P<0.05)，兩組性別、年齡、WBC、PLT、HBV-DNA、肺部感染占比、腹膜炎占比、ALB、Cr、PTA比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組臨床資料比較

續(xù)表1 兩組臨床資料比較

2.3兩組血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表達(dá)水平比較 死亡組血清miR-125b-5p表達(dá)水平高于生存組，而miR-146a-5p表達(dá)水平低于生存組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表達(dá)水平比較

2.4兩組血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表達(dá)水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，血清miR-125b-5p表達(dá)水平與TBil、AST、ALT呈正相關(guān)(P<0.05)，血清miR-146a-5p表達(dá)水平與TBil、AST、ALT呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表達(dá)水平與ALB無相關(guān)性(P>0.05)，見表3。部分相關(guān)指標(biāo)散點(diǎn)圖見圖2。

圖2 HBV-ACLF患者的血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表達(dá)水平與肝功能指標(biāo)相關(guān)性的散點(diǎn)圖(n=80)

2.5影響HBV-ACLF患者預(yù)后的多因素分析 建立COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，以預(yù)后狀況為因變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。以前述單因素分析(表1和表2)中P<0.05的指標(biāo)/因素為自變量?？紤]到樣本量尤其是陽(yáng)性樣本量較少，經(jīng)與臨床和統(tǒng)計(jì)專業(yè)的專家會(huì)商，將其中影響作用熟知的ALT、ALB兩指標(biāo)剔除，不納入回歸。此外，將部分為連續(xù)數(shù)值的自變量，參考兩組中位值進(jìn)行分段(分層)，轉(zhuǎn)化成二分類變量，以提高統(tǒng)計(jì)效率并使回歸結(jié)果清晰。各變量賦值見表4?；貧w過程采用逐步后退法，以進(jìn)行自變量的選擇和剔除，設(shè)定α剔除=0.10，α入選=0.05。結(jié)果顯示，消化道出血、肝性腦病及血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表達(dá)水平是HBV-ACLF患者預(yù)后的影響因素(P<0.05)。

表3 兩組患者血清miR-125b-5p、miR-146a-5p表達(dá)水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性

2.6血清miR-125b-5p、miR-146a-5p對(duì)HBV-ACLF預(yù)后的評(píng)估價(jià)值 進(jìn)一步探討血清miR-125b-5p、miR-146a-5p對(duì)HBV-ACLF預(yù)后的評(píng)估價(jià)值，采用兩種方法進(jìn)行分析。(1)兩指標(biāo)的單獨(dú)應(yīng)用：以死亡組為陽(yáng)性樣本，以生存組為陰性樣本，建立ROC曲線診斷分析模型，并采用組段建模模式。被分析指標(biāo)按樣本總水平數(shù)值范圍劃分為若干個(gè)組段，建立ROC曲線(折線)。再以軟件擬合ROC曲線，讀取約登指數(shù)最大值點(diǎn)，計(jì)算最佳臨界值和靈敏度、特異度。經(jīng)ROC曲線分析：兩指標(biāo)均具有較高的預(yù)后評(píng)估價(jià)值，曲線下面積(AUC)分別為0.733(95%CI0.597～0.869)、0.741(95%CI0.618～0.865)。(2)兩指標(biāo)的聯(lián)合應(yīng)用：采用SPSS23.0軟件聯(lián)合ROC曲線理論模式(LogP模式，對(duì)各單獨(dú)應(yīng)用指標(biāo)進(jìn)行綜合回歸，建立Logistic預(yù)測(cè)/診斷評(píng)估模型，再依據(jù)所得回歸系數(shù)，歸一化加權(quán)，計(jì)算并對(duì)應(yīng)處理各樣本資料，進(jìn)行兩指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用的ROC曲線分析)。結(jié)果提示，聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HBV-ACLF預(yù)后的評(píng)估價(jià)值較高，AUC為0.845(95%CI0.736～0.955)，比單一指標(biāo)檢測(cè)明顯提高，見表5、圖3。

圖3 血清miR-125b-5p、miR-146a-5p預(yù)測(cè)HBV-ACLF預(yù)后的ROC曲線

表4 影響HBV-ACLF患者預(yù)后的COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型

表5 血清miR-125b-5p、miR-146a-5p對(duì)HBV-ACLF預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

3 討 論

HBV-ACLF病情進(jìn)展迅速，死亡風(fēng)險(xiǎn)較高，這類患者具有個(gè)體差異大、發(fā)病誘因復(fù)雜等特點(diǎn)，目前尚無特效方案治療，主要通過對(duì)癥干預(yù)、積極預(yù)防或治療并發(fā)癥等方式緩解癥狀，延緩病情進(jìn)展[11]。盡早了解患者病情，判斷死亡風(fēng)險(xiǎn)對(duì)改善預(yù)后至關(guān)重要。既往常通過評(píng)估肝功能、Cr、PTA等指標(biāo)，了解HBV-ACLF進(jìn)展情況，但靈敏度與特異度并不理想[12]。目前，研究發(fā)現(xiàn)部分miRNA在肝臟疾病中存在特異性表達(dá)，例如薛揚(yáng)等[13]研究提示，ACLF患者的血清miR-130a表達(dá)水平升高，其與患者預(yù)后密切相關(guān)。高飛等[14]也發(fā)現(xiàn)，miR-130a在ACLF患者血清中呈高水平表達(dá)，且與患者預(yù)后有關(guān)。但總體而言，關(guān)于這類患者miRNA表達(dá)水平的報(bào)道較少，且所選擇的指標(biāo)比較局限，臨床仍需增設(shè)相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析。隨著醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展，有學(xué)者指出，miR-125b-5p、miR-146a-5p在肝臟疾病中發(fā)揮了一定作用，與肝損傷、肝臟代謝、肝臟發(fā)育密切相關(guān)，可能影響疾病的進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸[15]。故臨床可考慮利用二者評(píng)估HBV-ACLF患者預(yù)后，為臨床診療提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，與HBV-ACLF生存者相比，死亡患者的血清miR-125b-5p表達(dá)水平明顯升高，而miR-146a-5p表達(dá)水平下降，表明血清miR-125b-5p、miR-146a-5p可能影響預(yù)后。miR-125b-5p是miRNA中的重要成員，具備促進(jìn)細(xì)胞吞噬的功能，隨著肝損害程度加重，miR-125b-5p異常表達(dá)越明顯[16]。miR-125b-5p導(dǎo)致肝損傷加重的機(jī)制可能在于，其過表達(dá)可對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及金屬蛋白酶進(jìn)行靶向介導(dǎo)，加重肝損害，此外，其異常表達(dá)還可下調(diào)還原酶P450活性，使還原化途徑阻斷，引起肝細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致肝損傷加重[17]。由此可見，血清miR-125b-5p可能是HBV-ACLF患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加的潛在預(yù)后生物標(biāo)志物。miR-146a-5p在多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá)，如在胃癌、前列腺癌中表現(xiàn)為低表達(dá)，而在甲狀腺癌、黑色素瘤中呈高表達(dá)，具體機(jī)制尚不明確[18]。這提示miR-146a-5p在不同疾病中的表達(dá)存在特異性，臨床需予以重視。本研究提示，miR-146a-5p低表達(dá)可增加HBV-ACLF患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，間接表明其對(duì)肝功能可能有保護(hù)作用。有研究指出，miR-146a-5p能降低白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子-α水平，從而達(dá)到抑制炎癥的目的[19]。miR-146a-5p表達(dá)水平較高的HBV-ACLF患者可能因炎癥較輕，能減輕肝損害，而表達(dá)較低的患者炎癥較重，加重了肝損害，繼而增加死亡風(fēng)險(xiǎn)。本研究還觀察了二者與肝功能的相關(guān)性，結(jié)果提示血清miR-125b-5p表達(dá)水平與TBil、AST、ALT呈正相關(guān)，而血清miR-146a-5p表達(dá)水平與三者呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。這進(jìn)一步證實(shí)血清miR-125b-5p表達(dá)水平越高，患者的肝損害越重，而miR-146a-5p表達(dá)水平越低，患者肝損害越重，其表達(dá)水平越高，則有利于保護(hù)肝功能。

本研究結(jié)果顯示，血清miR-125b-5p、miR-146a-5p對(duì)HBV-ACLF患者的預(yù)后具有一定的評(píng)估價(jià)值。肝衰竭的主要特點(diǎn)在于肝細(xì)胞壞死，這也是增加死亡風(fēng)險(xiǎn)的重要原因，對(duì)預(yù)后影響極大[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b-5p過表達(dá)能促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡及壞死，機(jī)制可能在于其有利于乙型肝炎表面抗原編碼區(qū)序列的靶向聚合，參與宿主被病毒侵襲的過程[21]。miR-125b-5p可能通過過表達(dá)的這一機(jī)制，影響HBV-ACLF患者預(yù)后。miR-146a-5p則可通過對(duì)多種炎癥因子進(jìn)行調(diào)控，發(fā)揮其抑制炎癥的作用，緩解肝損傷，而一旦miR-146a-5p表達(dá)水平降低，則可能促進(jìn)炎癥因子釋放，導(dǎo)致肝損傷患者的炎癥加重，進(jìn)一步損害肝功能，從而影響預(yù)后[22]。在未來的HBV-ACLF治療中，臨床可將miR-125b-5p、miR-146a-5p作為靶向基因，據(jù)此研究新的治療思路。此外，本研究經(jīng)COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析證實(shí)，消化道出血、肝性腦病及血清miR-125b-5p、miR-146a-5p是患者預(yù)后的影響因素。消化道出血、肝性腦病均為肝衰竭患者的嚴(yán)重并發(fā)癥，已有研究證實(shí)二者為肝病患者預(yù)后的影響因素[23-24]。miR-125b-5p過表達(dá)可能通過影響還原酶P450活性，參與宿主被病毒侵襲等過程，促進(jìn)肝損害。而miR-146a-5p低表達(dá)可能通過促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放，加重機(jī)體炎癥，促進(jìn)肝損害。二者均與肝功能受損密切相關(guān)，能加重HBV-ACLF患者病情嚴(yán)重程度，導(dǎo)致死亡風(fēng)險(xiǎn)加大。

綜上所述，與HBV-ACLF生存者相比，死亡者的血清miR-125b-5p表達(dá)水平明顯上調(diào)，而miR-146a-5p表達(dá)水平下調(diào)，二者與血清TBil、AST、ALT均有相關(guān)性，可作為預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。此外，本研究也有不足之處，如僅選擇80例樣本且僅觀察了1年的預(yù)后，未來還需延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，對(duì)此進(jìn)行多中心、大樣本的研究。