鄧 蕊, 余蘇云，吳媛媛，李曉曼，陳文星,2，王愛云,2，陸 茵,2

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1. 藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2. 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

胃癌已成為全球范圍內(nèi)第五大常見癌癥及第三大癌癥相關(guān)死亡原因[1]，近2/3的患者最終面臨死亡。目前癌癥的診斷技術(shù)及治療手段雖在不斷發(fā)展，但胃癌患者的預(yù)后狀況并沒有得到顯著改善，手術(shù)切除仍是胃癌患者預(yù)后最好的治療方式[2]。此外，靶向治療藥物的開發(fā)也取得了一定的成效，如靶向人表皮生長因子受體2(HER2)的曲妥珠單抗(trastuzumab)及靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的雷莫蘆單抗(ramucirumab)，對實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療及個(gè)性化醫(yī)療意義重大。然而，這些療法的治療效果有限且對患者的生活質(zhì)量有較大影響。因此，新型胃癌治療靶點(diǎn)仍是目前研究的焦點(diǎn)。

近年來，瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)通道蛋白成為腫瘤治療領(lǐng)域的一類“明星”治療靶點(diǎn)[3]。生理情況下，TRP作為多種細(xì)胞內(nèi)、外界環(huán)境信號的感受器，通過被溫度或相應(yīng)的配體激活后，介導(dǎo)Ca2+等陽離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)生理活動(dòng)。病理狀態(tài)，包括在惡性腫瘤發(fā)展過程中，TRP蛋白存在異常表達(dá)現(xiàn)象，而這往往與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程有著密不可分的關(guān)系[4]。

TRPA1作為目前TRPA(ankyrin)亞家族中的唯一成員，能夠被大蒜素(allicin)、肉桂醛(cinnamaldehyde)等化合物所激活。近年來研究證實(shí)，TRPA1的激活在前列腺癌、鼻咽癌的增殖、生長及轉(zhuǎn)移過程起重要作用[5-6]。同時(shí)，Takahashi等[7]證明了TRPA1在浸潤性導(dǎo)管乳腺癌組織中存在異常表達(dá)情況，其通過Ca2+依賴的抗凋亡途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的化療耐受性。但關(guān)于TRPA1與胃癌發(fā)展進(jìn)程的文章較為缺乏，因此，本研究從TRPA1表達(dá)情況與胃癌進(jìn)程的相關(guān)性入手，初步探討其在胃癌轉(zhuǎn)移過程中的具體作用，并對其可能作用機(jī)制及潛在治療藥物進(jìn)行探尋。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株均為南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥效與安全性評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自存。所有細(xì)胞均由1640培養(yǎng)基(含10%FBS)培養(yǎng)基放置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基粉末購于Gibco公司(貨號：31800022)；胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)購于Gibco公司(貨號：10100-147)；胰酶購于Amresco公司(貨號：R223-01)；Transwell小室購于Corning公司(貨號：3422)；結(jié)晶紫購于源葉生物科技有限公司(貨號：B26890)；CCK-8購于APExbio公司(貨號：K1018)；小豆蔻明(Cardaomin)購于源葉生物科技有限公司(CAS：19309-14-9, 貨號：B21380)；HC030031購于MCE公司(貨號：HY-15064)；TRPA1抗體購于愛博泰克生物科技有限公司(貨號：A8568)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 多功能酶標(biāo)儀(Biotek, Synergy2)；長時(shí)間細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)(Essen, IncuCyte Zoom)；電泳儀(Bio-Rad, 型號Mini protean 3 cell)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad, 型號ChemiDoc XRS+)；梯度PCR儀(Applied Biosystems, 型號Cycler)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, 型號7500)；熒光倒置顯微鏡(Zeiss, 型號AX10)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用 ① 打開Kaplan-Meier plotter在線數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com/analysis/); ②進(jìn)入胃癌患者相關(guān)生存曲線分析界面；③在“Affy id/ Gene symbol”欄輸入“TRPA1”，選擇Affmetrix ID為208349_at的樣本進(jìn)行分析；④點(diǎn)擊“Draw Kaplan-Meier plot”，獲取TRPA1基因表達(dá)水平與胃癌患者生存期的相關(guān)性信息。

1.2.2CCK-8檢測MKN-45細(xì)胞活力 將MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合度90%左右，以每孔7×103個(gè)的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。設(shè)計(jì)溶劑對照組、小豆蔻明(1、2、4、8、16、32、64、128 μmol·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，之后利用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3長時(shí)間細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像及數(shù)據(jù)分析 以每孔7×103個(gè)細(xì)胞的密度將MKN-45細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，給予不同濃度HC030031(0.5、1、2、4、8、16、32、64 μmol·L-1)，設(shè)置空白對照及溶劑對照，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，隨后將培養(yǎng)板放至長時(shí)間動(dòng)態(tài)成像系統(tǒng)中，每隔1 h進(jìn)行全板掃描，共掃描72次，成像結(jié)束后利用系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理。

1.2.4Transwell檢測MKN-45細(xì)胞遷移能力 利用無血清1640培養(yǎng)基處理MKN-45細(xì)胞過夜后，用胰酶消化并分別使用含不同濃度小豆蔻明(2、4、8 μmol·L-1)及等體積含DMSO的培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行重懸，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞密度接種100 μL于上室，下室加入800 μL含30%FBS培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室，用4%多聚甲醛固定10 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗干凈并風(fēng)干后拍照。

1.2.5化合物3D結(jié)構(gòu)下載 登錄美國國家生物技術(shù)信息中心 (NCBI) 數(shù)據(jù)庫 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在下拉菜單中選擇PubChem Compound，以cardamonin為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，選擇CID號為641785的化合物進(jìn)行下載，并以SDF格式保存。

1.2.6蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)下載 登錄Protein Data Bank蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB (http://www1.rcsb.org/)，以TRPA1為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，選擇PDB號為6PQO的蛋白質(zhì)進(jìn)行下載，以PDB格式進(jìn)行保存。

1.2.7成分-靶點(diǎn)分子對接 將已下載的TRPA1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SYBYL-X 2.0，使用Automatic模式尋找蛋白中的最佳結(jié)合口袋。隨后導(dǎo)入cardamonin結(jié)構(gòu)，并勾選“Perform CScore Calulations”項(xiàng)，使用Total Score及CScore進(jìn)行評價(jià)，篩選出CScore≥4且Total Score最高的結(jié)合模式。

1.2.8Western blot檢測TRPA1蛋白水平表達(dá)情況

1.2.8.1檢測胃癌細(xì)胞與正常胃上皮細(xì)胞中TRPA1表達(dá)情況 將細(xì)胞分別接種于六孔板中，細(xì)胞生長至融合度到80%-90%時(shí)，提取蛋白，將蛋白統(tǒng)一至25 μg依次上樣，電泳、轉(zhuǎn)印等步驟后，一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST洗滌3次，二抗室溫孵育1.5 h，1× TBST洗滌3次。最后用化學(xué)發(fā)光法在凝膠系統(tǒng)中進(jìn)行曝光顯影，對結(jié)果進(jìn)行半定量分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8.2檢測小豆蔻明對MKN-45細(xì)胞TRPA1蛋白表達(dá)水平影響 將人源胃癌細(xì)胞株MKN-45接種于6孔板中，細(xì)胞生長至融合度至70%左右時(shí)，每孔分別加入不同濃度的小豆蔻明(2、4、8 μmol·L-1)及等體積含DMSO的培養(yǎng)基孵育24 h，隨后按“1.2.8.1”所述操作進(jìn)行檢測。

1.2.9GC-MS代謝產(chǎn)物分析

1.2.9.1色譜條件 色譜柱：HP-5毛細(xì)管色譜柱(30 m x 0.25 mm，0.25 μm, Agilent公司)；載氣：高純氦氣；流量：1.0 mL·min-1；分流比：20 ∶1；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：280 ℃；升溫程序：初始溫度為60 ℃，保持1 min，隨后以20 ℃·min-1升溫至320 ℃，維持5 min。

1.2.9.2質(zhì)譜條件 離子源：電子電離源(EI)；電離能量：70 eV；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度：300 ℃；質(zhì)譜掃描范圍：m/z50-550。

1.2.9.3樣本收集 胃癌細(xì)胞與正常胃上皮細(xì)胞代謝差異分析：取對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的GES-1，AGS，BGC-823，MGC-803和MKN-45細(xì)胞，以PBS洗滌細(xì)胞3次后，用刮刀刮取培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，4 ℃離心(1 200 r·min-1，10 min)，收集細(xì)胞沉淀，保存于液氮中，用于細(xì)胞內(nèi)代謝組學(xué)分析。每種樣本平行6份。

1.2.9.4樣品前處理 按照參考文獻(xiàn)[8]方法處理細(xì)胞，凍干的細(xì)胞裂解物加60 μL的0.1%甲酸水溶液，使其復(fù)溶，4 ℃離心(13 000 r·min-1，10 min)，取上清于液相小瓶中。以混合各自等分試樣的樣品為質(zhì)控樣本，空白為提取溶劑。

1.2.9.5數(shù)據(jù)處理與分析 將采集的GC-MS原始數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入MS-DIAL軟件中進(jìn)行色譜峰提取和物質(zhì)鑒定，得到包含代謝物名稱、保留時(shí)間、質(zhì)荷比及峰高三維信息數(shù)據(jù)集，歸一化后數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)，以VIP值>1，P值<0.05為條件，篩選正常人胃粘膜上皮細(xì)胞(GES-1)與四種不同胃癌細(xì)胞(AGS，BGC-823，MGC-803，MKN-45)的差異性代謝物。運(yùn)用MetaboAnalyst 4.0(http://www.metaboanalyst.ca/)網(wǎng)站進(jìn)行代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 TRPA1表達(dá)水平與胃癌患者生存期呈負(fù)相關(guān)對TRPA1與胃癌患者生存期相關(guān)性進(jìn)行分析(Fig 1A-C)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者總生存期(overall survival，OS)，首次進(jìn)展生存期(first progression，F(xiàn)P)，再進(jìn)展生存期(post progression survival，PPS)均與TRPA1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)生存曲線，由此提示我們，TRPA1與胃癌進(jìn)程密切相關(guān)，其表達(dá)水平升高可能對胃癌發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。

Fig 1 The mRNA expression of TRPA1 in gastric cancer patients significantly negatively correlated with their survival

2.2 TRPA1在胃癌細(xì)胞中異常高表達(dá)基于上述數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計(jì)結(jié)果，進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)對胃正常上皮細(xì)胞(GES-1)及多株胃癌細(xì)胞(MGC-803、MKN-45、BGC-823、AGS)TRPA1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(Fig 2)。由于TRPA1是一種瞬時(shí)離子通道蛋白，其蛋白層次表達(dá)水平指示著蛋白功能的發(fā)揮。因此，我們使用Western blot 對不同細(xì)胞間TRPA1蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，與正常胃上皮細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞TRPA1的表達(dá)水平明顯更高。其中，MKN-45細(xì)胞TRPA1蛋白表達(dá)水平最高。

Fig 2 TRPA1 overexpressed in gastric cancer cells

2.3 HC-030031抑制胃癌細(xì)胞遷移作為一類瞬時(shí)離子通道蛋白，TRPA1的激活能夠介導(dǎo)以Ca2+為主的一系列陽離子流入細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生一系列下游的生理及病理效應(yīng)。同時(shí)，上述研究結(jié)果均表明，胃癌中存在TRPA1異常高表達(dá)現(xiàn)象，那么這種異常表達(dá)現(xiàn)象是否與胃癌發(fā)展進(jìn)程存在一定相關(guān)性？于是，我們利用選擇性TRPA1抑制劑HC-030031，對TRPA1與胃癌轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性進(jìn)行探索。首先，我們利用長時(shí)間動(dòng)態(tài)活細(xì)胞成像設(shè)備在無需標(biāo)記及不影響細(xì)胞活動(dòng)的狀態(tài)下對MKN-45細(xì)胞進(jìn)行長時(shí)間觀察成像(Fig 3A，B)，選擇不影響MKN-45細(xì)胞增殖活力的4、8 μmol·L-1進(jìn)行體外驗(yàn)證。利用Transwell從垂直角度驗(yàn)證TRPA1與胃癌遷移的關(guān)系，如Fig 3C所示，使用HC-030031處理細(xì)胞后，細(xì)胞的垂直遷移能力受到了明顯抑制，且與給藥劑量存在劑量依賴性。

2.4 小豆蔻明與TRPA1的結(jié)合潛力為進(jìn)一步從抗腫瘤中藥中篩選能夠有效抑制TRPA1的化合物，我們利用虛擬篩選對TRPA1的潛在抑制劑進(jìn)行尋找。文獻(xiàn)檢索過程中發(fā)現(xiàn)，小豆蔻明能夠選擇性抑制TRPA1介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，并具有濃度依賴性[9]。進(jìn)而，我們利用分子對接技術(shù)對小豆蔻明與TRPA1的結(jié)合能力進(jìn)行研究，對接結(jié)果如Fig 4所示，小豆蔻明能夠有效地嵌入TRPA1蛋白的活性腔結(jié)合口袋中，且CSCORE評分為滿分5分，表明該對接結(jié)果一致性良好。由此，小豆蔻明與TRPA1蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)，并可能抑制TRPA1功能的發(fā)揮。

2.5 小豆蔻明減少胃癌細(xì)胞TRPA1蛋白表達(dá)為探究小豆蔻明對胃癌細(xì)胞中TRPA1表達(dá)的影響，我們選用TRPA1表達(dá)水平相對最高的MKN-45細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。給予MKN-45細(xì)胞不同濃度的小豆蔻明(2、4、8 μmol·L-1)刺激24 h后，對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取，并對細(xì)胞TRPA1蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示(Fig 5)，一定濃度范圍內(nèi)，小豆蔻明能夠劑量依賴性抑制TRPA1蛋白表達(dá)。說明小豆蔻明在抑制TRPA1功能發(fā)揮的同時(shí)，具有抑制TRPA1功能蛋白表達(dá)的作用。

2.6 小豆蔻明抑制胃癌細(xì)胞遷移CCK-8結(jié)果顯示 (Fig 6A)，小豆蔻明在一定濃度范圍內(nèi)(1-16 μmol·L-1)對MKN-45細(xì)胞的增殖活力沒有影響。由此，選擇2、4、8 μmol·L-1的小豆蔻明進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，探究小豆蔻明對MKN-45細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示 (Fig 6B, C)，使用小豆蔻明對細(xì)胞進(jìn)行處理后，與TRPA1抑制劑HC-030031相似，細(xì)胞的遷移能力被明顯抑制了，且這種抑制作用存在劑量依賴性。

Fig 3 Metastasis of MKN-45 cells in vitro inhibited by HC-030031

Fig 4 Docking analysis of TRPA1 and cardamonin

2.7 細(xì)胞代謝輪廓的分析為進(jìn)一步探究小豆蔻明抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的內(nèi)在機(jī)制，GC-MS技術(shù)被用于探究正常細(xì)胞與胃癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物差異，以及小豆蔻明對差異代謝物的影響。從細(xì)胞樣本中共鑒定得到45個(gè)小分子代謝物，以計(jì)算各代謝物在QC樣本中峰面積的RSD值，超過90%的化合物RSD值小于30%，表明實(shí)驗(yàn)操作及儀器穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。結(jié)果見Fig 7A。利用SIMCA-P 13.0軟件構(gòu)建PLS-DA模型。得分圖如Fig 7B所示，模型參數(shù)為R2X=0.921，R2Y=0.907，Q2=0.829，表明所建模型穩(wěn)定可靠。結(jié)果顯示，GES-1樣本與4種胃癌細(xì)胞樣本區(qū)別明顯，且相隔較遠(yuǎn)，表明其正常胃上皮細(xì)胞與胃癌細(xì)胞中代謝物存在明顯差異。

Fig 5 Expression of TRPA1 protein inhibited by cardamonin

2.8 細(xì)胞代謝差異產(chǎn)物的鑒定將正常人胃粘膜上皮細(xì)胞 (GES-1) 分別與4種胃癌細(xì)胞兩兩比較，對篩選出的差異代謝物進(jìn)行鑒定，分別得到10種(GES-1 vs AGS)，7種(GES-1 vs BGC-823)，3種(GES-1 vs MGC-803)和7種(GES-1 vs MKN-45)代謝物。對上述代謝物數(shù)據(jù)歸一化處理后進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明正常細(xì)胞與胃癌細(xì)胞的代謝產(chǎn)物差異較大，見Fig 8。對差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，正常細(xì)胞與4種胃癌細(xì)胞有2個(gè)共有差異代謝物：天冬酰胺 (L-Asparagine) 和肌醇 (myo-inositol),且胃癌細(xì)胞中天冬酰胺含量均增加，肌醇含量均出現(xiàn)減少。由此，與天冬酰胺及肌醇相關(guān)代謝途徑可能在誘導(dǎo)胃癌進(jìn)程中起著重要作用。

Fig 6 Metastasis of MKN-45 cells in vitro inhibited by cardamonin

Fig 7 Analysis of differential metabolites after cardamonin treatment

Fig 8 Heatmap visualization of different metabolites of GES-1 and gastric cancer cells

2.9 小豆蔻明對共有細(xì)胞代謝差異產(chǎn)物的影響提取正常細(xì)胞 (GES-1)、胃癌細(xì)胞 (MKN-45)以及給藥后胃癌細(xì)胞(MKN-45)中天冬酰胺(L-Asparagine)和肌醇(myo-inositol)的峰面積。以正常細(xì)胞代謝水平為基準(zhǔn)，給以8 μmol·L-1小豆蔻明后，天冬酰胺和肌醇的代謝物水平均有所回調(diào)。見Fig 9。

Fig 9 Relative levels of L-asparagine and myo-inositol between GES-1, MKN-45 and MKN-45-CAR-8 μmol·L-1

2.10 相關(guān)代謝通路富集分析將上述鑒定得到的差異代謝產(chǎn)物導(dǎo)入MetaboAnalyst 4.0網(wǎng)站中進(jìn)行代謝通路富集分析，以影響值>0.1為條件，篩選得到9條相關(guān)代謝通路，見Fig 10。包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成；谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝；苯丙氨酸代謝；甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；氨?；?tRNA的生物合成；酪氨酸代謝；磷酸肌醇代謝；精氨酸生物合成等代謝通路，其中圓點(diǎn)大小表示該代謝通路的重要程度。

Fig 10 Metabolic pathway enrichment of different metabolites of GES-1 and gastric cancer cells

3 討論

小豆蔻明(cardamonin，CAR)為存在于姜科山姜屬植物草豆蔻(AlpiniakatsumadaiHayata)干燥近成熟種子中的一種黃酮類化合物。目前研究證實(shí)，小豆蔻明在多種疾病中的潛在治療作用已得到廣泛研究，包括疼痛，炎癥性腸炎及癌癥在內(nèi)的多種疾病類型[10]。目前，Wang等[11]在胃癌細(xì)胞AGS中證實(shí)，小豆蔻明通過抑制LncRNA-PVT1的表達(dá)，下調(diào)p-STAT3水平，并阻斷STAT3的激活，以誘導(dǎo)AGS細(xì)胞凋亡。同時(shí)，小豆蔻明具有劑量依賴性抑制TRPA1介導(dǎo)的鈣內(nèi)流作用?？紤]到TRPA1的異常表達(dá)情況與腫瘤進(jìn)程的相關(guān)性，我們提出科學(xué)假說，小豆蔻明抑制胃癌發(fā)展進(jìn)程作用的發(fā)揮是否跟TRPA1有關(guān)，其具體機(jī)制又是怎樣？進(jìn)一步文獻(xiàn)檢索后我們發(fā)現(xiàn)，小豆蔻明能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞代謝抑制乳腺癌進(jìn)程[12]，促使我們思考，正常細(xì)胞與胃癌細(xì)胞是否存在代謝產(chǎn)物的差異，通過靶向這種差異是否可能逆轉(zhuǎn)腫瘤進(jìn)程？

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TRPA1在胃癌細(xì)胞中存在異常高表達(dá)現(xiàn)象，并與胃癌患者不良預(yù)后呈正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比正常胃上皮細(xì)胞，胃癌細(xì)胞中TRPA1蛋白表達(dá)水平更高，且具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移能力的作用，TRPA1抑制劑的給予逆轉(zhuǎn)了TRPA1的促轉(zhuǎn)移作用。同時(shí)，分子對接結(jié)果顯示，小豆蔻明可能作為一種潛在的TRPA1抑制劑，呈現(xiàn)出與TRPA1抑制劑相似的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用。進(jìn)一步利用細(xì)胞代謝組學(xué)對不同細(xì)胞的代謝差異產(chǎn)物進(jìn)行分析，挖掘出天冬酰胺及肌醇相關(guān)通路可能為小豆蔻明抑制TRPA1介導(dǎo)的胃癌轉(zhuǎn)移的重要途徑。

本研究使用GC-MS技術(shù)，對正常胃上皮細(xì)胞及多株胃癌細(xì)胞系的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測及分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常胃上皮細(xì)胞相比，胃癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物出現(xiàn)顯著變化，且多株胃癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物存在交集，即胃癌細(xì)胞中天冬酰胺的產(chǎn)生均增加，而肌醇的產(chǎn)生均出現(xiàn)下降趨勢。結(jié)合TRPA1在胃癌中的異常表達(dá)現(xiàn)象及小豆蔻明對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的抑制作用，我們猜想，天冬酰胺及肌醇相關(guān)的代謝通路是小豆蔻明通過TRPA1發(fā)揮抑制胃癌轉(zhuǎn)移的可能途徑。

上世紀(jì)80年代，已有文章證實(shí)，急性粒細(xì)胞型白血病細(xì)胞無法合成天冬酰胺，而依賴于正常細(xì)胞中合成的天冬酰胺，為腫瘤細(xì)胞供應(yīng)能量，由此，靶向循環(huán)系統(tǒng)中的天冬酰胺能夠有效殺死腫瘤細(xì)胞[13]。而肌肉肌醇 (myo-inositol) 是人體中含量最高的一種肌醇，占全部肌醇含量的90%以上[14]，近年來，由于其在多種疾病包括腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的潛在治療作用被廣泛報(bào)道，受到了人們的重視[15]。我們證實(shí)，胃癌細(xì)胞中存在肌醇水平下降而天冬酰胺水平上升的現(xiàn)象。說明天冬酰胺或許是腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的標(biāo)志性代謝差異產(chǎn)物，靶向天冬酰胺藥物的開發(fā)可能對于臨床腫瘤的治療起著一定的參考意義，而肌醇水平的恢復(fù)或許也是治療腫瘤的可能途徑。進(jìn)一步對給予小豆蔻明前后MKN-45細(xì)胞差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)小豆蔻明在一定程度上具有恢復(fù)肌醇水平并抑制天冬酰胺的作用。靶向天冬酰胺及肌醇或許是小豆蔻明發(fā)揮抑癌作用的重要途徑，有待進(jìn)行更深入地研究。

代謝組學(xué)作為一門研究內(nèi)源性代謝小分子化合物含量變化的新興技術(shù)，能夠用以分析潛在腫瘤標(biāo)志物，擴(kuò)充基因組學(xué)及蛋白組學(xué)的研究結(jié)果。本研究基于GC-MS代謝組學(xué)手段，對正常胃上皮細(xì)胞及胃癌細(xì)胞的差異代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，未來還可利用核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)及液相色譜-質(zhì)譜法等技術(shù)手段對各類惡性腫瘤的代謝產(chǎn)物進(jìn)行代謝譜解析，構(gòu)建系統(tǒng)精準(zhǔn)的癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物庫。此外，給予藥物刺激后再次檢測細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物差異，能夠更加直觀的揭示藥物對細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用[16]，對于抗腫瘤藥物的開發(fā)具有重要意義。進(jìn)一步聯(lián)合蛋白組學(xué)與基因組學(xué)共同分析，并應(yīng)用于腫瘤的診斷、治療甚至預(yù)防過程，有益于指導(dǎo)臨床構(gòu)建個(gè)體化治療方案，為精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)現(xiàn)提供技術(shù)手段。