王佳慧，汪 磊，彭 岳，原鮮玲，趙鐵建，鄭 洋

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 1.賽恩斯新醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)系，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理教研室，廣西 南寧 530222)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝臟對于各種慢性刺激的損傷修復(fù)反應(yīng)，主要以肝星狀細(xì)胞 (hepatic stellate cells，HSC)受到外界刺激被活化從而產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積為主要特點(diǎn)，HF是慢性肝病進(jìn)程中的關(guān)鍵階段，進(jìn)一步發(fā)展會導(dǎo)致肝硬化，甚至肝癌，有研究表明恰當(dāng)有效的治療措施可以逆轉(zhuǎn)HF[1-3]。

微小RNAs(microRNA，miRNA)屬于非編碼小核糖核酸中的一類，主要通過與mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)的結(jié)合調(diào)控mRNA的表達(dá)，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致其可以參與細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞死亡、代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程的調(diào)節(jié)[4-5]。在HF方面，目前研究認(rèn)為miRNA主要通過影響HSC的增殖及活化、ECM的產(chǎn)生及降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)方面參與HF發(fā)生、發(fā)展過程。如miR-150和miR-194的過表達(dá)可抑制LX2細(xì)胞增殖、下調(diào)CollagenI和α-SMA表達(dá)[6]；miR-125b在多種肝病中表達(dá)失調(diào)，在非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)小鼠模型中，miR-125b通過調(diào)控RhoA通路，從而導(dǎo)致HF的發(fā)生[7]。miR-125b與HF關(guān)系密切，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不明確，故本次研究使用細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法，希冀闡明miR-125b對HSC表型的影響，為HF的防治以及藥物的研發(fā)提供新的標(biāo)靶。

1 材料

1.1 儀器低速離心機(jī)(廣州吉迪儀器有限公司，JIDI-20D)、水平搖床(上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司，T200)、酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，mullSKANMK3)、倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX51)、流式細(xì)胞儀(BECKMAN，CytoFLEX)、RT-PCR儀(ABI，QuantStudio 6)。

1.2 細(xì)胞株大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)Procell 貨號:CL-2317。

1.3 試劑MTT(BIOSHARP，0793)、 CollagenⅠ(220KD)(Abcam，ab260043)、CollagenⅢ(138KD)(abcam，ab34710)、β-actin(42KD)(Servicebio, GB12001)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物，KGA1026)、 Lip2000(賽墨飛，12566014)、miR-125b相關(guān)片段(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將HSC-T6進(jìn)行復(fù)蘇后接種于無菌培養(yǎng)瓶中，加入含10% FBS和1%高糖DMEM培養(yǎng)液，將其置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選用生長旺盛的對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取對數(shù)生長期的HSC-T6進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將其分為空白組、過表達(dá)組(mimics)、過表達(dá)對照組(mimics NC)、抑制組(inhibitor)、抑制對照組(inhibitor NC)，除空白組外，各組按如下操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染：將各組用無血清培養(yǎng)基配成miRNA-DMEM 終濃度為20 nmol·L-1，為了增加轉(zhuǎn)染的成功率加入Lipofec-tamineTM2000試劑，將其配制為濃度5 mL·L-1，而后加入相應(yīng)的孔中每孔1 mL。轉(zhuǎn)染結(jié)束后將轉(zhuǎn)染液替換成完全培養(yǎng)基用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT檢測各組細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，胰酶消化后，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到7×107個(gè)·L-1，接入96孔板，對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法見上述，每組3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)3個(gè)時(shí)間段，每孔加入10 μL MTT，37 ℃培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)基，酶標(biāo)儀測定吸光值。

2.4 細(xì)胞流式檢測各組細(xì)胞凋亡取對數(shù)期的HSC-T6細(xì)胞，胰酶消化后，用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到7×107個(gè)·L-1，接入96孔板，對細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用PBS將細(xì)胞洗2次，1 500 r·min-1，3 min；按照凋亡試劑盒操作說明進(jìn)行，然后檢測。

2.5 RT-PCR檢測miR-125b、CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)將各組細(xì)胞按“2.2”處理后，在細(xì)胞中加入1 mL TRIzol試劑，提取總的RNA。棄上清，加入無RNase的75%乙醇1 mL，離心5 min。棄上清，干燥RNA沉淀5-10 min，將沉淀溶于20 μL DEPC水中。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，用RT-PCR檢測相應(yīng)分子的表達(dá)，miR-125b、U6、CollagenⅠ、CollagenⅢ和β-actin上下游引物及長度見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences

2.6 免疫印跡檢測CollagenⅠ、Collagen Ⅲ表達(dá)將各組細(xì)胞按轉(zhuǎn)染操作處理后，提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA法測定各組細(xì)胞蛋白濃度，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，用TBST液室溫?fù)u床封閉2 h，然后加入Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、β-actin 抗體4 ℃過夜，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，通過ECL顯色系統(tǒng)顯色，用BandScan分析膠片灰度值。

3 結(jié)果

3.1 轉(zhuǎn)染后miR-125b的含量被提高或者下降當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)束后，用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染各組miR-125b的表達(dá)量，結(jié)果如Fig 1所示。轉(zhuǎn)染miR-125b mimics及inhibitor后，過表達(dá)組miR-125b的表達(dá)明顯高于mimics NC組和空白對照組(P<0.05)，而inhibitor組則沒有檢測到miR-125b表達(dá)，說明該組沒有miR-125b表達(dá)，進(jìn)一步表明inhibitor具有很好的抑制作用，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染操作順利完成，將miR-125b模擬物或抑制物導(dǎo)入細(xì)胞后，成功的調(diào)控了細(xì)胞miR-125b的表達(dá)，構(gòu)建了成功的細(xì)胞模型。

Fig 1 Expression of miR-125b in each group

3.2 miR-125b可以調(diào)控HSC的增殖當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)束后測定3個(gè)時(shí)間段的細(xì)胞增殖率(24、48、72 h)，以此判斷miR-125b對HSC細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果表明miR-125b mimics 組與miR-125b mimics NC組相比，3個(gè)時(shí)間段均對細(xì)胞的增殖有抑制作用，但是只有72 h的抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);miR-125b inhibitor組與inhibitor NC組相比，3個(gè)時(shí)間段均對細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，但只在72 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-125b可以調(diào)控HSC增殖，詳細(xì)情況見Fig 2。

Fig 2 HSC proliferation after miR-125b transfection n=3)

3.3 miR-125b可以調(diào)控HSC細(xì)胞的凋亡當(dāng)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)束后，按照凋亡試劑盒上的操作方法檢測各組HSC細(xì)胞的凋亡情況。轉(zhuǎn)染48 h后，各組的凋亡率情況分別為，mimics組：( 8.23 ± 0.56 )%,mimics NC組：( 6.15± 0.26)%,inhibitor組：(2.54 ± 0.51)%,inhibitor NC組：(5.23± 0.56)% 。轉(zhuǎn)染48 h后，mimics組凋亡率提高，具有促進(jìn)HSC凋亡的作用;inhibitor 組凋亡率下降，具有抑制HSC凋亡的作用，并且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-125b可以調(diào)控HSC凋亡，見Fig 3。

Fig 3 Effect of miR-125b on HSC apoptosis n=3)

3.4 miR-125b可以抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA的表達(dá)當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)束48 h后，miR-125b mimics 組具有抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA表達(dá)的作用；miR-125b inhibitor組具有促進(jìn)Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ mRNA表達(dá)的作用，與陰性對照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-125b抑制了膠原的生成，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的沉積的作用，具有確切的抗肝纖維化的作用。

Fig 4 Effect of miR-125b on Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ mRNA expression n=3)

3.5 miR-125b可以抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 蛋白的表達(dá)當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)束48 h后，過表達(dá)組具有抑制Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 表達(dá)的作用；抑制組具有促進(jìn)Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達(dá)的作用，與陰性對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 5。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-125b表達(dá)量的增加，具有抗膠原生成的作用。

Fig 5 Effect of miR-125b on expression of Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ n=3)

4 討論

HF被認(rèn)為是由于各種慢性肝損傷而產(chǎn)生的一種傷口愈合性病理應(yīng)答過程，以ECM的積累為特征[8]。HSC的激活被認(rèn)為是HF的重要關(guān)鍵步驟[9-10]。目前關(guān)于HF的防治工作已經(jīng)取得了長足的發(fā)展，其主要的工作關(guān)注點(diǎn)是HSC的增殖和凋亡[11-12]。miRNA是一類內(nèi)源性表達(dá)的18-25個(gè)核苷酸長的非編碼調(diào)節(jié)RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在細(xì)胞的多種生理過程中具有重要的調(diào)控作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miRNA可與編碼蛋白質(zhì)的信使RNA(mRNA)的3'-非翻譯區(qū)(UTR)堿基配對，從而調(diào)控mRNA的表達(dá)[13]。miRNA作為基因表達(dá)的調(diào)節(jié)分子，可以調(diào)控HSC的生理功能來參與HF的發(fā)生發(fā)展過程[14-15]。

本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)染的方式來探究miR-125b對HSC表型的影響。因?yàn)檗D(zhuǎn)染miRNA存在單雙鏈的問題，所以需要選擇其相應(yīng)的陰性序列進(jìn)行比較對照。研究結(jié)果顯示，當(dāng)在HSC細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)量增加時(shí)，HSC合成的 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)會下降，并且HSC細(xì)胞的增殖會受到抑制以及凋亡率會增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而當(dāng)HSC細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)量下降時(shí)，HSC合成的 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達(dá)會增加，并且HSC細(xì)胞的增殖會受到促進(jìn)以及凋亡率會被抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ECM的過度沉積是HF主要的病理特征，而Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ是ECM的主要組成部分，而miR-125b可以減少Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表達(dá)；抑制HSC增殖促進(jìn)其凋亡是防治HF的有效策略，而miR-125b可以抑制HSC增殖促進(jìn)HSC凋亡，綜合以上表明miR-125b具有確切的抗肝纖維化的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可以靶向作用于Hedgehog信號通路上重要的轉(zhuǎn)錄因子Gli3減少其表達(dá)，從而抑制HSC的激活。miR-125b還可以通過作用于RhoA通路，調(diào)控HSC遷移以及影響其收縮，抑制HSC的激活過程。本次研究表明，miR-125b通過抑制HSC增殖，促進(jìn)其凋亡，減少細(xì)胞外基質(zhì)Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的產(chǎn)生，呈現(xiàn)抗肝纖維化的作用，但是具體的分子機(jī)制引起我們課題組進(jìn)一步深入思考，例如miR-125b通過什么途徑調(diào)控HSC，miR-125b是否通過調(diào)控肝內(nèi)炎癥反應(yīng)抑或是調(diào)控肝內(nèi)血管新生反應(yīng)參與HSC生理過程，miR-125b呈現(xiàn)的抗肝纖維化的作用是否存在多靶點(diǎn)的調(diào)控作用。課題組進(jìn)一步希望通過二代測序進(jìn)一步探究miR-125b上游信號分子lncRNA和cricRNA的差異表達(dá)，以及通過蛋白組學(xué)尋找肝纖維化中顯著表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，從而闡明miR-125b分子調(diào)控肝纖維化的完整信號網(wǎng)絡(luò)。綜上，miR-125b可以成為防治肝纖維化研究工作新的靶位點(diǎn)。