馬稔秋 崔麗娟 杜煒

2018 年口腔癌新發(fā)病例約35.5 萬，引起相關死亡約17.7萬[1]，其中口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)占全部口腔癌的90%以上。手術聯(lián)合化療的治療方案在臨床收獲了較好的療效，但中晚期及復發(fā)OSCC的患者預后不佳，明確OSCC進展的機制對于相關診斷標志物及藥物靶標的發(fā)現(xiàn)具有重要價值。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是表觀遺傳及轉錄調控的關鍵參與者，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，包括OSCC[2-3]，但以目前的發(fā)現(xiàn)仍不足以完全闡明影響OSCC進展的調控網(wǎng)絡。本研究通過生物信息學檢索發(fā)現(xiàn)與OSCC患者預后密切相關的LncRNA LINC00705，并通過分子生物技術明確了LINC00705的體外生物學效應及相關機制，揭示了該分子在OSCC診斷及治療應用中的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及儀器

人胚腎細胞293T、人口腔上皮細胞系HOEC及人OSCC細胞系CAL-27、SCC-4、SCC-9、SCC-25及Tca8113(上海生命科學研究院)；DMEM、DMEM/F12培養(yǎng)基及胎牛血清(FBS)(Hyclone，美國)；RNAiso Plus(Trizol)、逆轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit、核酸熒光染料SYBR Green I(Takara，日本)；慢病毒包裝載體、plvx-LINC00705及plvx-Vector載體、miR-143-3p mimic及NC mimic(上海漢恒生物)；轉染脂質體Lipofectamine MessengerMAX(Thermo，美國)；CCK-8試劑(上海翊圣生物)；Tranwell小室及Matrigal基質膠(BD，美國)；Passive Lysis Buffer(PLB)裂解液、Luciferase Assay Reagent II及psiCHECK2載體(Promega，美國)。

1.2 臨床樣本資料

收集內蒙古赤峰學院附屬醫(yī)院口腔科2018 年09 月 01日～2019 年12 月20 日收治的46 例OSCC患者，所有患者均首次診斷為惡性腫瘤，術前未行任何形式的抗腫瘤治療，所有提供腫瘤及癌旁組織的患者均對本研究知情同意，并簽字。

1.3 細胞培養(yǎng)及處理

293T、CAL-27、SCC-4、SCC-9、SCC-25細胞采用DMEM+10%FBS培養(yǎng)，Tca8113細胞采用DMEM/F12+10%FBS培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境：37 ℃+5%CO2。利用慢病毒轉染技術在Tca8113細胞中轉染LINC00705過表達及相應的空白對照載體作為過表達組及空白組，在過表達組細胞中轉染miR-143--3p mimic作為回復組；在SCC-9細胞中轉染LINC00705敲降載體1#、2#及相應的干擾對照載體作為干擾1組、干擾2組及對照組。轉染方法：在對數(shù)生長期的293T細胞中利用脂質體轉染慢病毒包裝載體+目的載體(1.5 μg)，收集病毒懸液與完全培養(yǎng)基1∶1混合培養(yǎng)Tca8113或SCC-9細胞3 d，1 μg/mL嘌呤霉素篩選細胞2 周以上。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

TRIzoL試劑提取臨床組織樣本或各組細胞的總RNA，逆轉錄試劑盒對1 μg總RNA進行逆轉錄，另取1 μg總RNA進行miR-143-3p特異性的逆轉錄，轉錄產物cDNA稀釋至500 μL，將β-Actin、LINC00705及miR-143-3p引物與相應cDNA產物混合，在10 μL SYBR Green I體系中進行反應，反應條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min擴增循環(huán)30 次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。以β-Actin為內參基因，2-ΔΔCT公式計算LINC00705及miR-143-3p的相對表達水平。

1.5 CCK-8實驗

以1 000 個/孔細胞密度接種各組細胞于96孔細胞培養(yǎng)板中，每組設置5 個重復孔，在細胞貼壁后的0、24、48、72 h及96 h于待測孔中加入10 μL CCK-8試劑，避光于37 ℃+5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)3 h，檢測450 nm處吸光度(A)值，以各時間點相比0 h A值增高的倍數(shù)衡量細胞相對增殖能力。

1.6 Transwell侵襲及遷移實驗

無血清培養(yǎng)基稀釋10×Matrigel基質膠，滴加至Transwell小室上室面中央，風干6 h后無血清培養(yǎng)基水化10 min備用。各組細胞消化重懸后進行細胞計數(shù)，調整細胞濃度至5×105個/mL并以含培養(yǎng)基+1%FBS重懸，200 μL細胞懸液接種至Transwell小室，下室面加入600 μL培養(yǎng)基+10%FBS，以含Matrigel基質膠的Transwell小室為侵襲模型，未含Matrigel基質膠的Transwell小室作為遷移模型，37 ℃+5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h，無水乙醇固定細胞10 min，0.1%結晶紫染色20 min，40×顯微鏡下拍照，采用ImageJ軟件進行細胞計數(shù)。

1.7 熒光素酶報告基因實驗

構建LINC00705全長序列+psiCHECK2載體(psiCHECK2-705)，接種293T細胞于6孔細胞培養(yǎng)板中，分為NC組及miR組，NC組通過脂質體轉染psiCHECK2-705載體及NC mimic，miR組轉染psiCHECK2-705載體及miR-143-3p mimic，轉染后48 h，200 μL PLB裂解液處理細胞30 min，取10 μL加入避光的96孔板中，100 μL預混Luciferase Assay Reagent II檢測熒光強度為RLU1，加入100 μL預混Stop&Glo Reagent檢測熒光強度為RLU2，以RLU1/RLU2作為各組相對熒光強度。

1.8 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，單因素方差分析比較計量資料多組間差異，兩兩比較采用SNK-q法，檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 生物信息技術分析LINC00705在 OSCC組織中的臨床表達特征

根據(jù)GEPIA平臺(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)中提供的數(shù)據(jù)顯示，頭頸鱗癌(head and neck squamous carcinoma，HNSC)組織中LINC00705表達顯著高于正常癌旁組織(P<0.01，圖 1A)，且高表達LINC00705的HNSC患者無病生存時間顯著低于低表達患者(P<0.01，圖 1B)。

圖 1 LINC00705在 OSCC組織中的表達特征

2.2 病理組織中LINC00705和miR-143-3p的表達

RT-qPCR結果顯示，相比正常癌旁組織，OSCC組織中LINC00705表達顯著增高(P<0.01，圖 2A)，miR-143-3p表達顯著降低(P<0.01，圖 2B)，兩者在OSCC組織中表達顯著負相關(R=-0.484，P<0.01，圖 2C)，圖 2D為口腔鱗癌組織HE染色。

圖 2 OSCC中LINC00705及miR-143-3p的表達及其相關性

2.3 各組細胞LINC00705及miR-143-3p的表達比較

RT-qPCR結果顯示，相比空白組，過表達組Tca8113細胞中LINC00705表達顯著增高，miR-143-3p表達顯著降低(P<0.01)，相比過表達組，回復組LINC00705表達無顯著變化(P>0.05)，miR-143-3p表達顯著增高(P<0.01，圖 3A)；相比對照組，干擾1組及干擾2組SCC-9細胞中LINC00705表達顯著降低(P<0.01)，miR-143-3p表達顯著增高(P<0.01，圖 3B)，圖 3C為細胞轉染后熒光表達情況。

圖 3 各組細胞中LINC00705及miR-143-3p表達的比較

2.4 各組細胞增殖能力的比較

CCK-8結果顯示，相比空白組，過表達組48 h及以后增殖能力顯著增高(P<0.05)，相比過表達組，回復組48 h及以后增殖能力顯著降低(P<0.01，圖 4A)；相比對照組，干擾1組及干擾2組48 h及以后增殖能力顯著降低(P<0.01，圖 4B)。

圖 4 各組細胞相對增殖能力的比較

2.5 各組細胞侵襲及轉移能力的比較

Transwell侵襲及遷移結果顯示，相比空白組，過表達組侵襲及遷移細胞數(shù)顯著增多(P<0.01)，相比過表達組，回復組侵襲及遷移細胞數(shù)顯著降低(P<0.01，圖 5)；相比對照組，干擾1組及干擾2組侵襲及遷移細胞數(shù)顯著降低(P<0.01，圖 5)。

圖 5 各組細胞的相對增殖能力

2.6 miR-143-3p對LINC00705熒光素酶表達的影響

LncBase Predicted v2平臺(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web)分析結果顯示，LINC00705與miR-143-3p存在堿基互補配對序列(圖 6)。熒光素酶報告基因結果顯示，相比共轉染NC mimic載體(NC mimic相對熒光表達量：1.000±0.126)，轉染miR-143-3p mimic可顯著降低LINC00705熒光素酶的表達(miR-143-3p mimic相對熒光表達量：0.319±0.045，P<0.01)。

圖 6 LINC00705與miR-143-3p預測結合區(qū)域

3 討 論

LncRNA在惡性腫瘤中重要的生物學價值已被廣泛的研究證實[4]，其可與蛋白直接結合，直接影響靶蛋白的結構及功能[5]，但更多是作為內源競爭RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)影響靶微小RNA(microRNA，miRNA)的生物學效應，進而間接調控miRNA的靶蛋白[6-7]。本研究通過生物信息技術發(fā)現(xiàn)LINC00705在OSCC組織中高表達，并與患者預后不良密切相關，提示LINC00705在OSCC中可能具有重要研究價值。而Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)LINC00705在乳腺癌復發(fā)患者的腫瘤組織中表達顯著上調，暗示了LINC00705可作為乳腺癌預測復發(fā)的潛在標志物，因此，對LINC00705的靶miRNA進行分析，結果顯示miR-143-3p與LINC00705轉錄本229-253序列存在互補序列，且連續(xù)互補片段為9-mer，提示結合可能性較強。而miR-143-3p被多項研究證實在不同來源的惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌作用：He等[9]發(fā)現(xiàn)miR-143-3p在食管鱗癌組織中表達顯著降低，且其低表達與患者預后不良密切相關，體內外研究顯示RNA結合蛋白QKI-5是miR-143-3p的直接靶蛋白，miR-143-3p可通過抑制QKI-5 mRNA的表達，介導細胞上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及細胞增殖轉移能力的抑制；Chen等[10]發(fā)現(xiàn)miR-143-3p在乳腺癌組織中低表達，且受到MYB原癌基因樣蛋白2(MYBL2)的負向調控，miR-143-3p的過表達可抑制乳腺癌細胞體內外的惡性表型；同時，miR-143-3p也參與調控OSCC的惡性表型，其被發(fā)現(xiàn)在OSCC組織中表達顯著降低，且作為lncRNA UCA1及MALAT1的靶基因，顯著抑制OSCC細胞的惡性行為[11-12]。另外miR-143-3p在結直腸癌、胰腺導管腺癌及宮頸癌中發(fā)揮抑癌作用[13-15]。

上述研究表明miR-143-3p作為抑癌因子在不同來源的惡性腫瘤中發(fā)揮生物學作用，而考慮到LINC00705在OSCC中有待闡明的生物學意義及其與miR-143-3p潛在的相互作用，本研究在OSCC臨床組織樣本中進行了LINC00705與miR-143-3p表達相關性的分析，結果顯示兩者表達顯著負相關，提示了兩者在OSCC中存在潛在的調控作用，體外研究顯示，過表達LINC00705可促進OSCC細胞的惡性表型，而干擾LINC00705則抑制細胞的增殖轉移能力。在回復miR-143-3p表達后，LINC00705的促癌作用被完全拮抗，同時，miR-143-3p對LINC00705熒光素酶的抑制作用提示兩者存在相互結合作用。綜上，本研究表明LINC00705可下調OSCC細胞中miR-143-3p的表達，促進細胞增殖及轉移能力。在接下來的研究中將以balb/c裸鼠為體內模型探究LINC00705的體內生物學效應，并通過擴大臨床樣本及長期隨訪，明確LINC00705的臨床意義，以期為相關藥物靶標及診斷試劑盒的研發(fā)提供關鍵依據(jù)。