楊立芬，何建清，尹立新，武 軍，高 然（.唐山市婦幼保健院婦產(chǎn)科 河北唐山 063000；.唐山市南湖醫(yī)院急診科，河北唐山 063000）

卵巢癌是婦科死亡率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命，卵巢癌具有早期診斷困難、易發(fā)生轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)[1-3]，且患者預(yù)后不良，因此深入探討卵巢癌的致病機(jī)制具有重要意義。殼多糖酶3 樣蛋白1（chitinase-3-like-protein-1, CHI3L1），又被稱為是一種分泌型糖蛋白，由腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分泌。研究表明在多種腫瘤的增殖、分化、浸潤(rùn)、血管形成和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[5-6]。LUO 等[7]人發(fā)現(xiàn)CHI3L1 過表達(dá)與轉(zhuǎn)移相關(guān)，是甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后不良的一個(gè)指標(biāo)。ANSARI 等[8]人發(fā)現(xiàn)腦脊液中星形細(xì)胞CHI3L1 驅(qū)動(dòng)HER2+乳腺癌皮層轉(zhuǎn)移。據(jù)報(bào)道CHI3L1 通過下調(diào)p53 促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并提高對(duì)西妥昔單抗的敏感性[9]。但CHI3L1 在卵巢癌患者中的表達(dá)以及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尚不清楚，因此本文通過構(gòu)建pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒，使得卵巢癌細(xì)胞中的CHI3L1 基因沉默，探討CHI3L1 對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3 增殖、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 人卵巢癌細(xì)胞SKOV3 購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，并用含10 g/dl FBS，100 U/ml 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑 BCA 蛋白定量試劑盒、蛋白電泳制膠所需試劑（上海生物工程有限公司）；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO 公司）；慢病毒表達(dá)載體 PLL3.7、載體質(zhì)粒（上海生物工程有限公司） ；PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司） ；Transwell 小室（美國(guó)Corning 公司）；熒光顯微鏡（德國(guó)Leica 公司）等。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒 ：根據(jù)Genbank 中CHI3L1（NM_001276.4）mRNA 序列和pll3.7 質(zhì)粒圖譜，Xho I 和Hpa I 限制酶作為酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物。將引物進(jìn)行退火，退火條件為 95℃ 5 min，90℃ 5 min，85℃ 5 min，80℃ 5 min，75℃ 5 min，70℃ 5 min，65℃ 5 min，60℃ 5 min，退火完成后取適量稀釋500 倍，4℃ 保存。37℃ 下，在體系中酶切質(zhì)粒。1%瓊脂糖凝膠電泳，之后膠回收純化DNA，將純化的 DNA 產(chǎn)物保存于-20 ℃ 。在體系中（Pll3.7 線性載體1 μl 、目的基因7 μl、T4 buffer 1 μl 、T4 連接酶1 μl）進(jìn)行膠回收產(chǎn)物連接，16℃ 水浴過夜。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，成功構(gòu)建pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將SKOV3 細(xì)胞種植在96 孔板中，每孔DMEM 培養(yǎng)液100 μl。1 天后，待細(xì)胞處于良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為3 組：①空白對(duì)照（非轉(zhuǎn)染組）；②陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染空載體）；③pll3.7-CHI3L1 shRNA 轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染pll3.7-CHI3L1 shRNA 質(zhì)粒），在轉(zhuǎn)染試劑中直接加入質(zhì)粒DNA，混勻后室溫靜置 10 min。然后在含細(xì)胞和完全培養(yǎng)液里加入轉(zhuǎn)染復(fù)合物。置于37℃，5ml/dl CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)。在熒光顯微鏡下觀察卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 Western Blot：配制細(xì)胞裂解液，制備CHI3L1 蛋白樣品，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）：分別制備濃縮膠和分離膠，上樣進(jìn)行電泳。電泳分離CHI3L1 蛋白后轉(zhuǎn)膜，用封閉液（5g/dl 脫脂奶粉+TBST）進(jìn)行封閉，室溫靜置1h。一抗雜交：加入1 ml 封閉液，再加適量的一抗，4℃孵育過夜。室溫下，將膜在磷酸鹽緩沖液中浸洗3 次，10 min/次。步驟同一抗雜交，取出膜，轉(zhuǎn)移至塑料自封袋中，加入二抗，室溫孵育1 h，然后再將膜在磷酸鹽緩沖液中浸洗3 次，10 min/次。將混合后的檢測(cè)試劑均勻加至雜交膜上，反應(yīng) 3 ～ 5 min。用薄膜覆蓋雜交膜，趕出多余發(fā)光液，在暗房中壓片、顯影。通過Western Blot 檢測(cè)CHI3L1 蛋白的表達(dá)。

1.3.4 平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)：用0.25%胰蛋白酶來(lái)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在10g/dl 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中。把細(xì)胞接種到培養(yǎng)液中，并在5 ml/dl CO2，37℃，飽和濕度下培養(yǎng)，直至出現(xiàn)肉眼可見的克隆。棄上清，PBS 浸洗，之后4g/dl 多聚甲醛固定15 min，0.1g/dl 結(jié)晶紫染色10～30 min，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.5 Transwell 實(shí)驗(yàn)：制作細(xì)胞懸液（制備細(xì)胞懸液前先讓細(xì)胞撤血清饑餓12～24 h，去除血清的影響）。消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸。將細(xì)胞懸液加入到Transwell 小室，下室一般加入含血清的培養(yǎng)液，上室加入不含血清的培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)12～48 h 后觀察細(xì)胞侵襲能力。取出Transwell 小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無(wú)鈣的PBS 清洗2 次，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，4 g/dl 多聚甲醛固定30 min，風(fēng)干。用 0.1g/dl結(jié)晶紫染色30～60 min，用PBS 洗3 次，用棉簽輕輕擦掉上室水分。顯微鏡下隨機(jī)五個(gè)視野觀察細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P﹤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 在熒光顯微鏡下觀察pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞48h 后的綠色熒光效果，觀察結(jié)果見圖1。觀察到大量的綠色熒光細(xì)胞，說(shuō)明pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染效率較高。

圖1 pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞

2.2 Western Blot 檢測(cè)pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3 細(xì)胞后CHI3L1 的表達(dá)情況 在pll3.7-CHI3L1 shRNA 轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3 以沉默CHI3L1 基因，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒作為陰性對(duì)照組（negative control，NC）。轉(zhuǎn)染48 h 后收集SKOV3 細(xì)胞。首先通過qPCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒后CHI3L1 mRNA 的變化，結(jié)果顯示和空白對(duì)照組相比（1.06±0.56），轉(zhuǎn)染NC對(duì)CHI3L1 mRNA水平幾乎無(wú)影響（1.03±0.74），轉(zhuǎn)染pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒后CHI3L1 mRNA 的水平下降（0.41±0.23）。Western Blot 檢測(cè)CHI3L1 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果見圖2。與空白對(duì)照組（1.12±0.47）和陰性對(duì)照組（0.98±0.54）相比，pll3.7-CHI3L1 shRNA 轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3后，SKOV3 細(xì)胞中CHI3L1 蛋白表達(dá)水平下降（0.23±0.41）。

圖2 Western Blot 檢測(cè)pll3.7-CHI3L1 shRNA 轉(zhuǎn)染SKOV3 細(xì)胞后CHI3L1 蛋白表達(dá)水平

2.3 平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)pll3.7-CHI3L1 shRNA 對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3 增殖的影響 通過平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)pll3.7-CHI3L1 shRNA 對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3 增殖的影響，結(jié)果見圖3。與空白對(duì)照組（1.05±0.49）和陰性對(duì)照組（1.09±0.72）相比，轉(zhuǎn)染pll3.7-CHI3L1 shRNA 后的卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的細(xì)胞克隆數(shù)減少，細(xì)胞相對(duì)克隆形成率降低（0.28±0.46）。說(shuō)明pll3.7-CHI3L1 shRNA 能抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的增殖。

圖3 平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)pll3.7-CHI3L1 shRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3 增殖的影響

2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pll3.7-CHI3L1 shRNA 對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3 侵襲能力的影響 通過Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pll3.7-CHI3L1 shRNA 對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3 侵襲能力的影響，結(jié)果見圖4。與空白對(duì)照組（0.94±0.52）和陰性對(duì)照組（0.92±0.81）相比，轉(zhuǎn)染pll3.7-CHI3L1 shRNA 后的卵巢癌細(xì)胞SKOV3的侵襲能力下降（0.25±0.61）。

圖4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pll3.7-CHI3L1 shRNA 對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3 侵襲能力的影響

3 討論

殼多糖酶3 樣蛋白1（CHI3L1），又名幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白1，是一種分泌型糖蛋白，分子量約40kDa，人類是由CHI3L1 基因編碼。CHI3L1 基因位于人類1 號(hào)染色體q32 的高度保守區(qū)域，含有10 個(gè)外顯子，基因組長(zhǎng)度約10.9 kb，編碼383 個(gè)氨基酸[10]。有研究揭示：CHI3L1 是一種調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化；CHI3L1 能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和腫瘤侵襲能力；CHI3L1 是血管平滑肌細(xì)胞的黏附和遷移因子，可以促進(jìn)血管生成和組織重塑，而腫瘤血管生成對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)至關(guān)重要。有研究表明HCC 組血清CHI3L1均顯著高于慢性乙型肝炎組和健康體檢組，對(duì)HCC 均具有很高的診斷效能[11]。另外發(fā)現(xiàn)血清CHI3L1 在肝硬化中具有很好的診斷效能[12]。表明CHI3L1 蛋白可能對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。

RNA 干擾技術(shù)是利用同源性雙鏈RNA 誘導(dǎo)mRNA 水平上目標(biāo)基因的沉默，從而起到抑制蛋白產(chǎn)物表達(dá)的目的。利用RNA干擾技術(shù)分析基因功能，探討腫瘤的基因靶向治療。LIBREROS 等[13]人研究發(fā)現(xiàn)：利用RNA 干擾技術(shù)可以抑制乳腺癌細(xì)胞中CHI3L1 的表達(dá)，引起趨化因子配體-2、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9 等的分泌減少，從而減弱腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。另外也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)沉默CHI3L1 基因，能抑制 CHI3L1 蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力的目的[14]。本文成功構(gòu)建pll3.7-CHI3L1 shRNA 重組質(zhì)粒，并發(fā)現(xiàn)下調(diào)CHI3L1 蛋白表達(dá)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的增殖。同時(shí)本文通過Transwell 實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)結(jié)果表明：CHI3L1 蛋白表達(dá)水平下調(diào)可以抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的侵襲能力，表明CHI3L1 在SKOV3 細(xì)胞中發(fā)揮的是癌基因的作用。

綜上所述，沉默卵巢癌細(xì)胞SKOV3 中CHI3L1基因，可以抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3 的增殖和侵襲能力。因此，本研究為卵巢癌的基因靶向治療提供了一個(gè)新的思路，CHI3L1 有可能作為卵巢癌靶向治療的有效基因靶標(biāo)。另外，KAWADA 等[15]人的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，CHI3L1 主要通過激活胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK） 和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號(hào)通路而產(chǎn)生誘導(dǎo)白介素-8 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）分泌的。還有文獻(xiàn)報(bào)道CHI3L1通過MAPK/ERK 和PI3K/AKT 磷酸化在食物過敏中Th2 炎癥和M2 巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生釋放促癌CHI3L1，激活了MAPK 信號(hào)通路[17]。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路有很多，考慮到CHI3L1 在其它腫瘤中的作用機(jī)制，我們猜想CHI3L1 調(diào)控卵巢癌細(xì)胞發(fā)展的機(jī)制也可能是通過信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，但是具體作用方式還需要進(jìn)一步探索。