王海東 林飛 林偉青

摘要 目的：觀察鼠曲草提取液對(duì)N-甲基亞硝基脲（MNU）誘發(fā)膀胱腫瘤的抑制作用，并初步探討其機(jī)制。方法：將120只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、高、中、低劑量組4組，每組30只。經(jīng)膀胱內(nèi)灌注MNU（1 mg/次，1次/2周，共4次）誘發(fā)膀胱腫瘤，對(duì)照組正常飲水，高、中、低劑量組分別以高、中、低劑量鼠曲草提取液代水喂食，于第12周處死全部大鼠，取其膀胱組織標(biāo)本，觀察其成瘤率。TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡情況，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)大鼠膀胱癌組織存活蛋白（Survivin）表達(dá)。結(jié)果：高、中、低劑量組大鼠膀胱癌成瘤率分別為60%（18/30）、75.86%（22/29）、86.21%（25/29），而對(duì)照組大鼠膀胱癌成瘤率為100%（28/28）。TUNEL法原位檢測(cè)發(fā)現(xiàn)鼠曲草提取液可顯著促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的調(diào)亡，且與劑量相關(guān);大鼠膀胱癌組織Survivin表達(dá)顯示鼠曲草提取液可顯著降低大鼠膀胱癌組織中Survivin表達(dá)。結(jié)論：鼠曲草提取液對(duì)大鼠膀胱癌形成有明顯抑制作用。

關(guān)鍵詞 鼠曲草;膀胱癌;甲基亞硝基脲;存活蛋白;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng);凋亡;成瘤率;黃酮類化合物

Abstract Objective：To observe the inhibitory effect of the gnaphalium affine extracts on the formation of N-methylnitrosourea（MNU）-induced bladder tumor in rats，and to initially explore its mechanism.Methods：A total of 120 SD rats were divided randomly into 4 groups，high，medium and low concentration group，with 30 cases in each group.Bladder tumor was induced by intravesical instillation of MNU（1 mg/ times，once every 2 weeks，4 times），inducing bladder tumors.The control group was given normal drinking water.High，medium and low doses groups were fed with high，medium and low concentration of the extract of gnaphalium affine extracts.All rats were killed at the 12th week，and their bladder tissue samples were taken to observe the difference in tumor formation rate.We took a specimen of its bladder tissue and observed its tumor formation rate.TUNEL method was used to detect the apoptosis of tumor cells.The expression of Survivin in rat bladder cancer tissues was detected by RT-PCR.Results：The tumor formation rate of bladder cancer in high，medium and low concentration groups was 60.11%（18/30），75.86%（22/29） and 86.21%（25/29） respectively，while the rate of bladder cancer in the control group was 100%（28/28）.In situ detection by TUNEL method，it was found that the gnaphalium affine extract can significantly promote the apoptosis of bladder cancer cells，which was related to the concentration; the expression of Survivin in rat bladder cancer tissues showed that the gnaphalium affine extract can significantly reduce the expression of survivin in rat bladder cancer tissues.Conclusion：The Gnaphalium affine extracts has a significant inhibitory effect on bladder cancer formation in rats.

Keywords Gnaphalium affine; Bladder cancer; N-methy-N-nitrosourea; Survivin; Reverse transcription polymerase chain reaction; Apoptosis; Tumor formation rate; Flavonoids

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.11.012

膀胱癌在我國(guó)是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，膀胱癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前臨床治療膀胱癌大多采取切除膀胱以及膀胱灌注卡介苗，但膀胱癌復(fù)發(fā)率仍較高，目前尚無(wú)高效安全的預(yù)防治療措施[1]。因此發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)，尋求高效低毒的方法，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者正積極研究探索有關(guān)防治方法，有關(guān)中藥抗腫瘤的研究近年來(lái)報(bào)道逐漸增多[2-3]。

鼠曲草（Gnaphalium affine D.Don）又名白艾、佛耳草、清明菜，是藥食兩用野生植物，在中國(guó)民間已有幾千年的使用歷史，廣泛用于各種疾病治療和保健。進(jìn)一步研究開發(fā)其藥用價(jià)值有著十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)嘗試通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究觀察比較鼠曲草提取液對(duì)大鼠膀胱癌形成是否存在抑制作用，初步探索鼠曲草對(duì)膀胱癌的預(yù)防機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取10～12周齡無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雌性SD大鼠120只，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK2010-0002。飼養(yǎng)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（20±2）℃，濕度40%～60%，12 h周期性光照環(huán)境，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食。該項(xiàng)目通過(guò)倫理審批委員會(huì)審批[倫理審批號(hào)：scxk（湘）2010-0002]。

1.1.2 試劑 N-甲基亞硝基脲（MNU）（Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：20130906），鼠曲草（江西醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科中藥房，貨號(hào)：201609080016）。鼠曲草提取液水提取物的制備按水煎煮工藝由江西省人民醫(yī)院制劑室自制，濃度分別為2 mg/mL，4 mg/mL，8 mg/mL。TUNEL試劑盒（上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)：20131217），安爾碘皮膚消毒劑（江西匯康實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：20150908），水合氯醛（批號(hào)：20130506）、甲醛（批號(hào)：20140308）購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 顯微鏡（上海豫光儀器有限公司，型號(hào)：WMF-3580），多功能酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士，型號(hào)：Infinite 200 PRO），熒光定量PCR擴(kuò)增儀（Roche，瑞士，型號(hào)：Light Cycler 480）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 所有SD大鼠使用前在實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、高、中、低劑量組4組，每組30只。以水合氯醛（濃度為10%，100 mg/kg）進(jìn)行腹腔內(nèi)注射，麻醉起效后將大鼠固定于仰臥位，用安爾碘皮膚消毒劑消毒大鼠尿道外口，以長(zhǎng)約5 cm的無(wú)菌硬膜外導(dǎo)管代替導(dǎo)尿管，涂抹無(wú)菌甘油后，行膀胱灌注MNU（劑量1 mg/mL），1 mL/次。1次/2周，共4次。

1.2.2 給藥方法 對(duì)照組正常飲水，高、中、低劑量組分別以高、中、低濃度鼠曲草提取液代水喂食。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 于第12周處死全部大鼠，取其膀胱組織標(biāo)本，低溫生理鹽水洗凈，10%甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片4～5 μm，行蘇木精-伊紅（HE）染色，置顯微鏡下觀察其病理變化。1）原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記TUNEL法檢測(cè)癌細(xì)胞凋亡：具體步驟按說(shuō)明書進(jìn)行，顯微鏡下凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)黑色為陽(yáng)性，每張切片中隨機(jī)選擇5個(gè)高倍（200倍）鏡視野，在每個(gè)視野中分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，每組中隨機(jī)選擇3張共1 500個(gè)細(xì)胞，同時(shí)統(tǒng)計(jì)其中所含的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)（%）=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/1 500×100%。2）Survivin檢測(cè)：通過(guò)Light Cycler 480熒光定量PCR擴(kuò)增儀采用巢式RT-PCR相對(duì)定量法檢測(cè)膀胱癌大鼠腫瘤組織中Survivin（280 bp）特異性mRNA條帶并以β-actin（309 bp）為參照[4]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其中計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示;計(jì)量資料的統(tǒng)計(jì)采用方差分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組SD大鼠的膀胱癌成瘤率 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于麻醉過(guò)量、感染和惡病質(zhì)，中、低劑量組大鼠各死亡1只，對(duì)照組死亡2只，對(duì)照組在第12周膀胱癌成瘤率為100%（28/28），高、中、低劑量組大鼠膀胱癌成瘤率分別為60%（18/30）、75.86%（22/29）、86.21%（25/29），比較各組膀胱癌成瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027）。

2.2 鼠曲草提取液對(duì)細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響 高、中、低劑量組大鼠膀胱癌細(xì)胞凋亡指數(shù)（此凋亡指數(shù)無(wú)單位，對(duì)照組數(shù)據(jù)后有%，高中低劑量組也有）分別為（12.424 2±0.282 6）%、（10.292 3±0.137 2）%、（8.577 8±0.143 5）%，對(duì)照組膀胱癌細(xì)胞凋亡指數(shù)為（4.083 3±0.105 7）%，組間方差分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），另經(jīng)相關(guān)性分析顯示大鼠膀胱癌細(xì)胞凋亡指數(shù)與鼠曲草劑量正相關(guān)。

2.3 鼠曲草提取液對(duì)大鼠膀胱癌組織中Survivin表達(dá)的影響 高、中、低劑量組大鼠膀胱癌組織中Survivin表達(dá)陽(yáng)性率分別為83.3%（15/18）;90.9%（20/22）;92%（23/25）;對(duì)照組膀胱癌組織中Survivin表達(dá)陽(yáng)性率為100%（28/28），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而高、中、低劑量組大鼠膀胱癌組織中Survivin表達(dá)分別為0.352 7±0.029 9、0.557 5±0.026 5、0.820 9±0.048 9;對(duì)照組膀胱癌組織中Survivin表達(dá)強(qiáng)度為1.223 9±0.071 1，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），另經(jīng)相關(guān)性分析顯示大鼠膀胱癌組織中Survivin表達(dá)強(qiáng)度與鼠曲草劑量正相關(guān)。見圖1。

3 討論

膀胱癌已成為中國(guó)男性常見的惡性腫瘤，據(jù)調(diào)查，城市人口膀胱癌發(fā)病率（6.47/10萬(wàn)）明顯高于農(nóng)村（4.30/10萬(wàn)），這可能與城市人口和農(nóng)村人口的飲食差別有關(guān)[5]，值得我們深入研究探索。

鼠曲草在我國(guó)各地均盛產(chǎn)，以野生為主，也分布于日本、朝鮮、菲律賓、印度尼西亞、中南半島、澳大利亞等地。每年清明節(jié)前后，各地民間尤其是農(nóng)民，食用方法不一，但基本都是全草食用，可新鮮食用也可曬干貯存，或水煮或拌入米面或玉米面后可食用，故有“清明菜、清明果”之稱，是清明時(shí)節(jié)最早可食的野菜，營(yíng)養(yǎng)豐富;同時(shí)具有食療的作用，可治療高血壓、支氣管炎、哮喘、風(fēng)濕性腰痛等多種疾病，是民間十分喜愛的傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)健康的野生蔬菜，有“仙草”之稱。鼠曲草具體成分十分復(fù)雜，含氨基酸、黃酮類化合物、揮發(fā)油、豆甾醇、生物堿等，據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，鼠曲草全草中所含的黃酮苷約為5%。黃酮類化合物經(jīng)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤、抗氧化、抗突變、抗過(guò)敏、抗菌、抗病毒、抗炎、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)和肝細(xì)胞的作用，還有殺蟲等非常廣泛的藥理作用，而且對(duì)人體毒性較低[6-7]。

Aritomi和Kawasaki[8]報(bào)道從鼠曲草花的甲醇提取物中分離鑒定出一種新發(fā)現(xiàn)的查耳酮：2′，4，4′-三羥基-6-甲氧基查耳酮（2′，4，4′-trihydroxy-6′methoxychalcone）和2種較常見黃酮類物質(zhì)：木犀草素（Luteolin）和木犀草素-4′-D-葡萄糖苷（Luteolin-4′-D-glucoside）。Morimoto等[9]研究發(fā)現(xiàn)從鼠曲草中分離提取得到黃酮類化合物有5-hydroxy-3，6，7，8-tetramethoxyflavone、5-hydroxy-3，6，7，8，4′-pentamethoxyflavone、4，4′，6′-trihydroxy-2′-methoxychalcone、5，6-dihydroxy-3，7-dimethoxy flavone等。Aquino等[10]報(bào)道從單花鼠曲草乙醇提取液中通過(guò)色譜分離和光譜方法，鑒定了一些肉桂酸衍生物和6種黃酮類化合物，它們分別是槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（Quercetin-3-O-β-D Glucopy Ranoside）、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（Quercetin-3-O-β-D-galactopy Ranoside-4′-O-β-D-glucopyranoside）、槲皮素（Quercetin）、蘆丁（Rutin）、山柰酚（Kaempferol）、異鼠李黃素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷（Isorhamnetin-3-O-β+D-galactopy Ranoside），通過(guò)3種不同的體外試驗(yàn)評(píng)估提取物的抗氧化活性：1）穩(wěn)定的1，1-二苯基-2-苦基肼基的漂白作用;2）由水溶性自由基引發(fā)劑2，2′-偶氮二（2-脒基丙烷）鹽酸鹽誘導(dǎo)的混合二棕櫚酰磷脂酰膽堿/亞油酸單層囊泡的過(guò)氧化反應(yīng);3）紫外線輻射誘導(dǎo)的磷脂酰膽堿多層囊泡中的過(guò)氧化反應(yīng)。在所有使用的體外試驗(yàn)中，ECR提取物顯示出顯著的抗氧化作用。此外，當(dāng)局部使用時(shí)，證明含有該提取物的凝膠制劑在健康人志愿者中提供針對(duì)中波紫外線誘導(dǎo)的皮膚紅斑的顯著體內(nèi)保護(hù)。Rockenbach等[11]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖作用可能至少部分地通過(guò)改變核苷酸的細(xì)胞外分解代謝而發(fā)生，可能是通過(guò)AMP積累，或者可能是阻斷了腺苷受體，支持槲皮素治療膀胱癌的潛在應(yīng)用。

本課題組經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鼠曲草中異澤蘭黃素（Eupatilin）和5-羥基-6，7，3′，4′-四甲氧基黃酮為首次從鼠曲草屬植物中分離得到，芹菜素（Apigenin）為首次從該植物中分離得到[12]。據(jù)國(guó)外研究報(bào)道鼠曲草成分中多種成分如Apigenin[13-14]和Eupatilin[15]等有較強(qiáng)的抗腫瘤作用。Suh等[13]研究發(fā)現(xiàn)Apigenin對(duì)SKOV3和SKOV3/TR細(xì)胞的抗增殖作用。RT-PCR和Western Blotting結(jié)果顯示，Apigenin在mRNA和蛋白水平顯著降低Axl和Tyro3受體酪氨酸激酶（RTKs）的表達(dá)，這是其細(xì)胞毒活性的原因。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Apigenin降低AKT磷酸化和B細(xì)胞淋巴瘤的水平-特別大（Bcl-xl或BCL2樣1同種型1），一種凋亡抑制劑。與這些結(jié)果相反，Apigenin對(duì)IL-6產(chǎn)生，STAT3和磷酸化STAT3蛋白水平?jīng)]有影響，表明Apigenin通過(guò)下調(diào)Axl和Tyro3表達(dá)，AKT磷酸化和Bcl-xl表達(dá)而發(fā)揮其抗增殖活性，但不是調(diào)節(jié)IL-6/STAT3軸。Tong等[14]報(bào)道：植物黃酮類芹菜素可預(yù)防和抑制中波紫外線誘導(dǎo)的皮膚癌發(fā)生，具有很強(qiáng)的抗增殖和抗血管生成作用，確定了芹菜素控制這些致癌事件的機(jī)制。研究顯示芹菜素至少部分地通過(guò)內(nèi)源性血管生成抑制劑血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP1）起作用。中波紫外線有效抑制表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的TSP1表達(dá)。它抑制皮膚血管生成和中波紫外線誘導(dǎo)的癌發(fā)生。我們顯示芹菜素恢復(fù)經(jīng)受中波紫外線的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的TSP1并使中波紫外線暴露的皮膚中的增殖和血管生成正?；Ｖ匾氖?，用中波紫外線照射的皮膚重建TSP1抗血管生成功能，其中短的生物活性肽模擬物僅代表其抗血管生成結(jié)構(gòu)域，再現(xiàn)了芹菜素的抗增殖和抗血管生成作用。Cox-2和HIF-1α是血管生成的重要介質(zhì)。芹菜素和TSP1肽模擬物都通過(guò)中波紫外線減弱它們的誘導(dǎo)。最后，研究發(fā)現(xiàn)了其分子機(jī)制，其中芹菜素不影響TSP1 mRNA，但從頭蛋白質(zhì)合成增加。敲減研究涉及RNA結(jié)合蛋白HuR，其控制mRNA穩(wěn)定性和翻譯。芹菜素增加HuR細(xì)胞質(zhì)定位和與TSP1 mRNA的物理結(jié)合，從而導(dǎo)致從頭TSP1合成。反過(guò)來(lái)，HuR細(xì)胞質(zhì)定位依賴于CHK2激酶?？傊芯堪l(fā)現(xiàn)了一種新機(jī)制，芹菜素通過(guò)該機(jī)制控制中波紫外線誘導(dǎo)的致癌作用。Park等[15]在人胃癌細(xì)胞系MKN-1中研究了Eupatilin的抗轉(zhuǎn)移作用。Eupatilin以劑量和時(shí)間依賴性方式抑制MKN-1生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，伴隨著Caspase-3活性的增加。ELISA證實(shí)了Eupatilin顯著降低炎癥介質(zhì)（IL-1β，TNF-α，IL-6和IL-8）的釋放。并且p-AKT和p-ERK（p44/42）減少。β-catenin和整合素的表達(dá)水平降低，p-GSKβ升高。在轉(zhuǎn)錄報(bào)告系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)內(nèi)因子核因子κB的活性被Eupatilin降低，當(dāng)用Eupatilin處理MKN-1細(xì)胞時(shí)p65的表達(dá)下調(diào)。此外，酶譜研究表明，這種侵襲能力的降低是由于Ⅳ型膠原溶解（明膠水解）活性的降低所致。用Eupatilin處理的MKN-1細(xì)胞中金屬蛋白酶（MMP-2和MMP-9）的表達(dá)也降低。在體外侵襲測(cè)定中，Eupatilin抑制MKN-1穿透重建的基底膜屏障。這些結(jié)果表明，Eupatilin通過(guò)激活caspase-3和胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，通過(guò)下調(diào)核因子κB活性，然后減少炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的MMPs表達(dá)來(lái)抑制MKN-1胃癌細(xì)胞增殖。

本實(shí)驗(yàn)采用MNU膀胱灌注誘導(dǎo)大鼠膀胱癌，在對(duì)照組成瘤率為100%，是國(guó)內(nèi)外最常采用的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短，成瘤率高。劑量為1 mg/mL，1 mL/次，讓膀胱適度充盈，膀胱黏膜充分接觸藥液，操作也更為簡(jiǎn)便。本實(shí)驗(yàn)采用鼠曲草水煮提取液代飲用水喂食，與民間加工、食用方法相似，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)鼠曲草還有抗膀胱癌的功效。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鼠曲草水提取液具有良好的抗腫瘤作用，且與其劑量相關(guān);其作用機(jī)制可能主要與其抗氧化作用和自由基清除作用等保健作用，另外其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡也是其抗腫瘤作用形成的關(guān)鍵機(jī)制，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道一致。進(jìn)一步從鼠曲草水提取液中找出其抗腫瘤的有效成分及其作用機(jī)制是擺在我們面前的一項(xiàng)難題，還需要做相當(dāng)煩瑣艱巨的實(shí)驗(yàn)研究工作。

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（2019-05-25收稿 責(zé)任編輯：王明）