商勝華 江艷 桑維鈞 張開虹 楊茂發(fā)

摘 要：為明確煙草莖點(diǎn)病菌廣生莖點(diǎn)霉Phoma omnivirens的最佳培養(yǎng)條件并篩選出有效的防治藥劑，為生產(chǎn)實(shí)踐中防治煙草莖點(diǎn)病提供理論依據(jù)。以病原菌P.omnivirens為試材，采用菌絲生長(zhǎng)速率法，研究了病原菌P.omnivirens的生物學(xué)特性，并測(cè)定了12種供試殺菌劑對(duì)病原菌的抑制效果。病原菌P.omnivirens的最適培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基;菌絲在5～30 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，最適溫度為30 ℃，5 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最慢;PDA培養(yǎng)基pH為10時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快;光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)無顯著影響;最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為硝酸鉀和硝酸鈣;菌絲的致死溫度為58 ℃ 10 min。12種殺菌劑中，3%中生菌素WP具有最佳抑菌效果，EC50最小，為0.9419 mg/L;其次是EC50為2.6940 mg/L的0.3%梧寧霉素AS和EC50為2.7917 mg/L的80%代森錳鋅WP。生產(chǎn)上可將這3種藥劑作為防治煙草莖點(diǎn)病的備選藥劑。

關(guān)鍵詞：煙草莖點(diǎn)病;廣生莖點(diǎn)霉;生物學(xué)特性;毒力測(cè)定

中圖分類號(hào)：S432.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2021）02-0001-08

國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.02.001

Abstract：In order to provide theoretical basis for prevention and control of tobacco black spot stalk，this study explored the biological characteristics of Phoma omnivirens and tested its virulence determination.The biological characteristics of P.omnivirens was analyzed by hypha growth rate method，and the effect of twelve fungicides on the pathogen were also determined.The results showed that Nutrient Agar（NA），Oatmeal Agar（OMA） and Potato Dextrose Agar（PDA） were the most suitable culture medium for the growth of P.omnivirens.The mycelium could grow in the temperatures ranging from 5 ℃ to 30 ℃，30 ℃ was the optimum temperature for mycelium growth，and the mycelium grew the slowest at 5 ℃.The mycelium grew fastest at pH 10 in PDA.Different light conditions did not significantly influence the growth of mycelium.The optimal carbon source for the medium were sucrose，and the best nitrogen sources were potassium nitrate and calcium nitrate，respectively.The lethal temperatures of mycelium was 58 ℃ for 10 min.Among the 12 fungicides，3% Zhongshengmycin had the best inhibitory effect with the lowest EC50 of 0.9419 mg/L;followed by 0.3% Tetramycin and 80% Mancozeb，with EC50 of 2.6940 mg/L and 2.7917 mg/L，respectively.These three fungicides can be used to control tobacco black spot stalk in the field.

Keywords：tobacco black spot stalk;Phoma omnivirens;biological characteristics;virulence determination

17世紀(jì)初葉，煙草開始傳入我國(guó)[1-2]，成為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在我國(guó)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展上起到了極大的促進(jìn)作用。但煙草病害的發(fā)生制約了煙葉產(chǎn)量的提高，使煙農(nóng)收入受到嚴(yán)重影響。截止2002年，已報(bào)道116種煙草病害，其中79種為侵染性病害，37種為非侵染性病害[3-4]。煙草莖點(diǎn)病是一種偶發(fā)性的真菌性病害，可危害黃花煙和普通煙，田間大多于成株期危害煙株莖基部，使養(yǎng)分和水分的疏導(dǎo)受阻，葉片早衰，嚴(yán)重時(shí)莖稈和葉片枯死，造成煙葉產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低[5]。研究煙草莖點(diǎn)病菌的生物學(xué)特性、篩選高效抑制病原菌生長(zhǎng)的殺菌劑對(duì)了解煙草莖點(diǎn)病的發(fā)生規(guī)律和生產(chǎn)上有效防治該病害具有重要意義。于莉等[6]最早在吉林省發(fā)現(xiàn)煙草莖點(diǎn)病，并將煙草莖點(diǎn)病病原鑒定為半知菌亞門Deuteromycotina，球殼孢目Sphaeropsidales，球殼孢科Sphaeropsidaceae，莖點(diǎn)霉屬Phoma，Phoma tabaci Em.Sousa da Camara。此后，該病害也僅在吉林[7-8]、陜西[9]和河南[10]三省有過報(bào)道，但均未開展深入研究。直至2018年，江艷等[11]在貴州省再次發(fā)現(xiàn)了煙草莖點(diǎn)病，并根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)技術(shù)將病原菌鑒定為廣生莖點(diǎn)霉Phoma omnivirens，致病性測(cè)定結(jié)果表明該病原菌可侵染煙株的葉片和莖稈。目前，還未見關(guān)于煙草莖點(diǎn)病病原菌生物學(xué)特性研究和防治該病害的相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)煙草莖點(diǎn)病菌P.omnivirens的生物學(xué)特性及室內(nèi)毒力測(cè)定進(jìn)行研究。以期能明確最適宜P.omnivirens生長(zhǎng)的條件，同時(shí)篩選出高效抑制其生長(zhǎng)的殺菌劑，為田間防治該病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：研究所用菌株為廣生莖點(diǎn)霉P.omnivirens，采集于貴州省貴安新區(qū)具有典型發(fā)病癥狀的煙草莖點(diǎn)病病株，經(jīng)分離、鑒定及致病性測(cè)定的病原菌菌株，現(xiàn)保存于貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室，菌株編號(hào)為HGUP8001。

供試藥劑：3%中生菌素WP，福建凱立生物制品有限公司;0.3%梧寧霉素AS，遼寧微科生物工程股份有限公司;80%代森錳鋅WP，四川國(guó)光農(nóng)業(yè)股份有限公司;20%苯醚甲環(huán)唑EW，青島瀚生生物科技股份有限公司;40%丙環(huán)唑ME，青島瀚生生物科技股份有限公司;70%甲基硫菌靈WP，江蘇龍燈化學(xué)有限公司;50%福美雙WP，河北贊峰生物工程有限公司;12.5%腈菌唑EW，青島瀚生生物科技股份有限公司;8%寧南霉素AS，德強(qiáng)生物股份有限公司;80%乙蒜素EC，河南科邦化工有限公司;8×108個(gè)/g蠟質(zhì)芽孢桿菌WP，山東泰諾藥業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的生物學(xué)特性研究

培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：參照方中達(dá)[12]的方法配置以下培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）、查氏培養(yǎng)基（Czapek）、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CDA）、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（MEA），pH為配制培養(yǎng)基時(shí)的自然值。供試菌株接于PDA平板， 25 ℃黑暗恒溫培養(yǎng)5 d，用打孔器沿菌落邊緣打孔，取打下的菌餅接于供試培養(yǎng)基平板中央，菌絲面朝下，每處理3個(gè)重復(fù)，置于25 ℃黑暗恒溫的同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌落情況，5 d后測(cè)量菌落直徑。該研究中接種的所有菌餅打取方法及接種方法如上，培養(yǎng)皿直徑均為90 mm，菌落直徑均使用十字交叉法測(cè)量。

溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：將5 mm菌餅接種于PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫黑暗培養(yǎng)，每處理3個(gè)重復(fù)，每日觀察，5 d后測(cè)量菌落直徑，培養(yǎng)基pH為配制時(shí)的自然值。

pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：用1 mol/L的稀鹽酸和1 mol/L的氫氧化鈉溶液將PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)為4、5、6、7、8、9、10、11，平板中央接入直徑5 mm的菌餅，每處理3個(gè)重復(fù)，25 ℃恒溫黑暗的同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察，5 d后測(cè)量菌落直徑。

光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：在PDA平板上接入直徑5 mm的菌餅，培養(yǎng)基pH為配制時(shí)的自然值，分別置不同光照（連續(xù)光照、24 h光暗交替和連續(xù)黑暗）條件下25 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理3個(gè)重復(fù)，每日觀察，5 d后測(cè)量菌落直徑。

菌絲致死溫度：在每支試管中裝入5 mL無菌水，并接入3個(gè)直徑為5 mm的菌餅，分別置于40、45、50、55、60、65、70 ℃的水浴鍋中恒溫水浴10 min，取出流水冷卻，將各處理的菌餅接于PDA平板，培養(yǎng)基pH為配制時(shí)的自然值，每平板1個(gè)菌餅，置于25 ℃恒溫黑暗的同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察，5 d后根據(jù)各處理能否長(zhǎng)出菌絲確定致死區(qū)間，能長(zhǎng)出菌絲的最高溫度為致死區(qū)間下限，無菌絲長(zhǎng)出的最低溫度為致死區(qū)間上限;區(qū)間內(nèi)以1 ℃為一個(gè)梯度，每溫度為一個(gè)處理，根據(jù)各處理能否長(zhǎng)出菌絲確定致死溫度，即不長(zhǎng)菌絲的最低溫度為菌絲致死溫度。

碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：以等量的麥芽糖、葡萄糖、甘露醇、乳糖、淀粉、果糖、肌醇代替查氏培養(yǎng)基中的蔗糖，同時(shí)蔗糖為碳源作為對(duì)照;以等量L-苯丙氨酸、氨基乙酸、草酸銨、L-精氨酸、L-谷氨酸、硝酸鉀、硝酸鈣、硫酸銨代替查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉，硝酸鈉為氮源作為對(duì)照，制成不同碳、氮源的培養(yǎng)基平板，接入直徑5 mm的菌餅，培養(yǎng)基pH均為配制時(shí)的自然值，25 ℃恒溫黑暗的同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察，5 d后測(cè)量菌落直徑。

1.2.2 室內(nèi)毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[13]，測(cè)定各供試殺菌劑對(duì)病原菌P.omnivirens的抑制作用，供試藥劑劑型及生產(chǎn)廠家見1.1。參照高亞星等[14]配制不同濃度梯度農(nóng)藥的方法，將供試藥劑用無菌水配制成各藥劑所需的濃度梯度的10倍，然后按9∶1 的比例將PDA培養(yǎng)基與所配藥劑混合，制成各濃度梯度的含藥平板，以加等量無菌水的培養(yǎng)基平板為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，各平板接入直徑為5 mm的菌餅，25 ℃黑暗條件恒溫培養(yǎng)，每日觀察，7 d后十字交叉法測(cè)量菌落直徑，并根據(jù)抑制率公式[15]計(jì)算各處理抑制率。

抑制率（%）=[（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）-（處理菌落直徑-菌餅直徑）]/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

研究數(shù)據(jù)用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和生長(zhǎng)速率計(jì)算，采用DPS 7.05的Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，采用Graphpad prism 7.0繪制柱形圖，用農(nóng)藥室內(nèi)試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件[16]計(jì)算毒力回歸方程Y=A+B*X，抑制中濃度EC50和相關(guān)系數(shù) R，X為藥劑濃度的對(duì)數(shù)值，Y為菌絲體抑制百分率的機(jī)率值。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原的生物學(xué)特性

2.1.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

煙草莖點(diǎn)病菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速率如圖1所示，在供試的7種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，最利于煙草莖點(diǎn)病菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是PDA、OMA和NA，菌絲生長(zhǎng)最快，與其他培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速率差異顯著，其次是CMA、Czapek、CDA，而在MEA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，生長(zhǎng)速率最小。

2.1.2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

如圖2所示，P.omnivirens在5～30 ℃條件下均能生長(zhǎng)，且隨著溫度的升高生長(zhǎng)越快，各處理的菌絲生長(zhǎng)速率差異顯著。5 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢，僅長(zhǎng)出少許稀薄的菌絲，30 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快且濃密，35 ℃及以上溫度時(shí)菌絲停止生長(zhǎng)。

2.1.3 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

如圖3所示，P.omnivirens對(duì)pH有較強(qiáng)的適應(yīng)性，在pH 4～11范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，在pH 4～10范圍內(nèi)生長(zhǎng)速率呈上升趨勢(shì)，pH 5～9之間各處理菌絲生長(zhǎng)速率差異不顯著，pH達(dá)到11時(shí)其生長(zhǎng)速率減慢，由此可知P.omnivirens既能適應(yīng)酸性環(huán)境，也能適應(yīng)堿性環(huán)境，最適生長(zhǎng)pH為10。

2.1.4 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

由圖4可以看出，P.omnivirens菌絲在3種光照條件（連續(xù)光照、24 h光暗交替和連續(xù)黑暗）下生長(zhǎng)速率差異不顯著，說明光照條件的變化對(duì)P.omnivirens菌絲的生長(zhǎng)速率影響不顯著，但菌絲顏色會(huì)隨著黑暗時(shí)間的增長(zhǎng)而加深。

2.1.5 菌絲的致死溫度

P.omnivirens在各預(yù)設(shè)溫度條件下水浴10 min后，小于等于55 ℃時(shí)菌絲均可生長(zhǎng)，大于等于60 ℃時(shí)菌絲不生長(zhǎng)，說明菌絲的致死區(qū)間為55～60 ℃;再此區(qū)間內(nèi)進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果顯示，58 ℃及以上溫度水浴10 min后菌絲均不生長(zhǎng)，說明菌絲的致死溫度為58 ℃ 10min。

2.1.6 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

研究結(jié)果表明，7種碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響存在差異（圖5），以蔗糖為碳源的查氏培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)最快，肌醇為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最慢，因此，蔗糖為最佳碳源。由圖6可知，P.omnivirens在9種氮源的查氏培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速率差異顯著，以硝酸鉀和硝酸鈣為氮源的培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)最快，其次是L-精氨酸和硝酸鈉，以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)最慢，因此硝酸鉀和硝酸鈣為最佳氮源。

2.2 室內(nèi)毒力測(cè)定

研究結(jié)果表明（表1），12種殺菌劑在對(duì)應(yīng)的濃度梯度范圍內(nèi)均對(duì)煙草莖點(diǎn)病菌有較好的抑菌作用，且抑制率與供試藥劑濃度呈正相關(guān)。80%代森錳鋅WP和50%福美雙WP在使用濃度分別為16 mg/L和500 mg/L時(shí)抑制率均大于90%。3%中生菌素WP、0.3%梧寧霉素AS和20%苯醚甲環(huán)唑EW隨濃度的增加抑制率均達(dá)85.97%～89.03%，其余藥劑隨濃度的增加抑制率也在63.5%～79.5%之間。

12種殺菌劑中，3%中生菌素WP的EC50最小，為0.9419 mg/L;其次是0.3%梧寧霉素AS和80%代森錳鋅WP，EC50值分別為2.6940 mg/L和2.7917 mg/L。40%丙環(huán)唑ME和20%苯醚甲環(huán)唑EW的EC50值也小于20 mg/L。抑制中濃度EC50是殺菌劑毒力的可靠標(biāo)準(zhǔn)，EC50越小，說明其抑菌效果越好[17]。因此，在12種殺菌劑中，3%中生菌素WP對(duì)煙草病菌的抑制效果最好，0.3%梧寧霉素AS和80%代森錳鋅WP次之。

3 結(jié)論與討論

病原菌的生物學(xué)特性是監(jiān)控病害發(fā)生的前提條件[18-19]，但目前未見P.omnivirens的生物學(xué)特性研究的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，煙草莖點(diǎn)病菌P.omnivirens對(duì)不同培養(yǎng)基、溫度、pH、碳氮源具有不同程度的適應(yīng)性，對(duì)不同光照條件的選擇無顯著差異;最適培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基和馬鈴薯培養(yǎng)基，3種培養(yǎng)基中，以馬鈴薯培養(yǎng)基配制最為簡(jiǎn)單、廉價(jià)，且在微生物相關(guān)研究中使用頻率高，因此本文其他部分的研究均使用該培養(yǎng)基作為供試培養(yǎng)基;最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，35 ℃及以上時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)，這與李海洋等[20]對(duì)同屬P.dictamnicol生物學(xué)特性的研究結(jié)果一致，說明該菌在高溫條件下不易存活，這或許是煙草莖點(diǎn)病目前尚未大面積發(fā)生的原因之一;菌絲在pH為4～11之間均可生長(zhǎng)，pH為10時(shí)菌絲生長(zhǎng)速率最大;最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為硝酸鉀和硝酸鈣，菌絲致死溫度為58 ℃ 10 min;不同光照條件下菌絲的生長(zhǎng)速率無顯著差異。

Phoma是一個(gè)廣泛分布的屬，在該屬已報(bào)道的3000種中有110種為病原菌，常引起植物葉片枯萎、根部腐爛甚至整株植株萎蔫[21]。本研究對(duì)煙草莖點(diǎn)病菌P.omnivirens的生物學(xué)特性的研究結(jié)果不僅有助于了解煙草莖點(diǎn)病的發(fā)生和病害循環(huán)，為防治該病害奠定基礎(chǔ)，也可為P.omnivirens引起的其他病害及同屬病原菌的相關(guān)研究提供參考。

目前，生產(chǎn)上的農(nóng)作物病蟲害防治主要還是依靠化學(xué)農(nóng)藥，但隨著人們對(duì)環(huán)境和食品安全要求的提高，生物農(nóng)藥也逐漸得到關(guān)注。本文采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定 12 種殺菌劑（7種化學(xué)殺菌劑和5種生物農(nóng)藥）對(duì)煙草莖點(diǎn)病菌P.omnivirens的室內(nèi)毒力，結(jié)果顯示生物農(nóng)藥3%中生菌素WP和0.3%梧寧霉素AS對(duì)菌絲的抑制效果最好，EC50分別為0.9419 mg/L和2.6940 mg/L，生產(chǎn)上也將這兩種生物農(nóng)藥用于防治其他病害[22-23]，可將其作為田間防治煙草莖點(diǎn)病的選用藥劑。同時(shí)，化學(xué)殺菌劑50%代森錳鋅WP也對(duì)煙草莖點(diǎn)病菌表現(xiàn)出較好的抑制效果，其EC50為2.7917 mg/L，也可作為生產(chǎn)上防治煙草莖點(diǎn)病的備選藥劑。但該研究選用的殺菌劑僅在室內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，具有一定的局限性。田間防治效果還與病原菌的孢子[24]、殺菌劑的特性[25]以及寄主植物的生長(zhǎng)環(huán)境等[26]有關(guān)，后續(xù)還需進(jìn)一步的田間防治試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。另外，針對(duì)不同地區(qū)的煙草莖點(diǎn)病，其病原菌菌株不同，生物學(xué)特性和防治藥劑是否一樣還需進(jìn)一步探究。

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