宋光均，曾 悅，何俊杰，蹇華麗*

（1.廣州標(biāo)旗光電科技發(fā)展股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東省光譜快速測量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510663；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

廣東省擁有全球最優(yōu)質(zhì)的荔枝資源，利用這些原料釀造出的荔枝酒芳香獨(dú)特，同時(shí)具有營養(yǎng)保健功能，是一種深受消費(fèi)者喜愛的果酒[1-2]。酒精度是荔枝酒發(fā)酵過程及成品酒質(zhì)量控制的關(guān)鍵因素。目前，國標(biāo)規(guī)定的酒精計(jì)（或密度瓶）法以及氣相色譜法被廣泛應(yīng)用于包含荔枝酒在內(nèi)的發(fā)酵酒酒精度檢測，但這些方法中樣品均需蒸餾，操作繁瑣，酒精易損失，檢測速度慢，而且檢測結(jié)果易有人為誤差，無法滿足發(fā)酵酒品質(zhì)監(jiān)控中快速檢測需求[3-4]。近十幾年以來，光譜分析技術(shù)以其快速無損、精確簡便等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸應(yīng)用于酒精度快速檢測。其中拉曼光譜由于乙醇特征信號易受其他物質(zhì)熒光干擾而普遍只應(yīng)用于白酒酒精度測量[5-9]，近紅外光譜則可用于葡萄酒、啤酒等發(fā)酵酒酒精度測量[10-13]，市場上也有少數(shù)國外生產(chǎn)的專用型近紅外光譜儀如葡萄酒分析儀（丹麥Foss公司）、酒精分析儀（奧地利Anton Paar公司）和快速酒精分析儀（比利時(shí)Unisensor公司）等供選擇[14-15]，但由于紅外光譜容易受水吸收峰干擾，對水溶液測定結(jié)果有一定影響[16]，且這些儀器價(jià)格昂貴，從而無法普及。

為解決目前發(fā)酵過程及成品酒酒精度測量過程中存在的實(shí)際問題，本實(shí)驗(yàn)擬采用美國Ocean Optics公司即插即用微型光纖光譜儀，利用拉曼光譜對荔枝酒發(fā)酵過程及成品酒酒精度進(jìn)行快速測定。通過不同方法對光譜進(jìn)行預(yù)處理，重點(diǎn)解決發(fā)酵酒中成分復(fù)雜，熒光嚴(yán)重干擾拉曼信號的問題[17-19]，同時(shí)采用向量角偏最小二乘法（vector angle partial least square，VAPLS）解決偏最小二乘法（partial least square，PLS）中乘性誤差對預(yù)測結(jié)果的干擾[20-22]，從而提高酒精度預(yù)測模型的穩(wěn)定性和預(yù)測能力。該方法的建立可實(shí)現(xiàn)高效、準(zhǔn)確、快速測定荔枝酒發(fā)酵過程及成品酒酒精度，并可通用于所有類型發(fā)酵酒，同時(shí)為后續(xù)開發(fā)價(jià)格低廉的便攜式酒精快速檢測儀以及實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程酒精度在線監(jiān)測奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝（淮枝品種）：廣東省從化市；活性干酵母（QA23、D47）：上海杰兔工貿(mào)有限公司；乙醇、亞硫酸（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)廠。

測試樣品共64個(gè)，其中采用體積分?jǐn)?shù)為99.0%乙醇配制不同酒精度酒樣30個(gè)（編號1～30）（見表1），荔枝酒發(fā)酵過程F1不同時(shí)段取樣18個(gè)（編號31～48），荔枝酒發(fā)酵過程F2不同時(shí)段取樣16個(gè)（編號49～64），所有樣品酒精度范圍為：1.0%vol～20.0%vol。選取配制酒精溶液樣品20個(gè)（酒精度為整數(shù)）用作建模校正集樣品，剩余配制酒精溶液樣品以及其他樣品共計(jì)44個(gè)作為驗(yàn)證集。

表1 配制酒精溶液的酒精度Table 1 Alcohol content of prepared alcoholic solutions

1.2 儀器與設(shè)備

QE65Pro拉曼光譜儀：美國Ocean optics公司；BQR-785-OEM光纖探頭、BQ-Laser-532激光器：廣州標(biāo)旗光電科技股份發(fā)展有限公司；全玻璃蒸餾器（500 mL，1000 mL）：廣州精科化玻儀器公司；精密酒精計(jì)（分度值0.1%vol）：河北衡水武強(qiáng)縣興隆儀表配件廠。

1.3 方法

1.3.1 荔枝酒加工工藝流程、操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：荔枝去皮去核，果肉中加亞硫酸至總二氧化硫120 mg/kg以及1‰檸檬酸后榨汁，4 ℃澄清24 h后調(diào)糖酸（總含糖量23%，pH 3.8），加入亞硫酸調(diào)整至總SO2質(zhì)量濃度為150 mg/L，以0.5%接種量接種已活化的活性干酵母，控制溫度15 ℃靜置發(fā)酵至酵母自然沉降，停止產(chǎn)氣。荔枝酒發(fā)酵過程F1（菌種為酵母D47）和F2（菌種為QA23）分別為18 d及16 d，發(fā)酵過程中每天定時(shí)取樣測定酒精度，當(dāng)酒精度趨于穩(wěn)定，終止發(fā)酵。經(jīng)過陳釀得到荔枝酒。

1.3.2 酒精計(jì)法測定樣品酒精度

參照食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》測定各樣品酒精度，酒精度表示為體積百分比（%vol）。

1.3.3 拉曼光譜數(shù)據(jù)采集

開機(jī)預(yù)熱光譜儀2 h；以空氣為參比，選用光程為10 mm的石英比色皿，利用QSpecSuiteV1.0光譜軟件采集樣品光譜。其激發(fā)光源波長為532 nm（激光器功率500 mW），光譜測定范圍為0～4 000 nm，分辨率10 cm-1，掃描步長4 cm-1，積分時(shí)間2 s，平滑參數(shù)1。每個(gè)樣品采集3條光譜曲線，將其平均值作為該樣品的原始光譜曲線。

1.3.4 樣品酒精度光譜測量分析模型建立

以相同校正集分別采用常規(guī)偏最小二乘法PLS及向量角偏最小二乘法VAPLS建模。

（1）VAPLS法建模主成分?jǐn)?shù)與分割步長的確定

設(shè)置校正集的光譜數(shù)據(jù)矩陣為A，校正集的酒精濃度為C；基準(zhǔn)光譜m（酒精度為20%vol樣本光譜）。將A、C、m導(dǎo)入計(jì)算平臺(tái)。首先根據(jù)二階差分值序列的折點(diǎn)初步判斷A的主成分?jǐn)?shù)p[23]，調(diào)用VAPLS算法程序，將A、m均被分為n段，即A=[A1，A2，……An]，m=[m1，m2，……mn]，計(jì)算得到不同的主成分?jǐn)?shù)pi和分割步長ki（i=1，2，……p）下的實(shí)測值與預(yù)測值相關(guān)系數(shù)R2（correlation coefficient）和均方根誤差（root mean square error，RMSE）[24]。

（2）VAPLS法模型建立

取相關(guān)系數(shù)R2最大和RMSE最小時(shí)的p與k，根據(jù)cosφ=（m·A）/|m||A|，求得A與m的夾角余弦矩陣，將光譜信號轉(zhuǎn)化為角度信號，即cosφ=［cosφ1，cosφ2，……cosφn］。將cosφ與C進(jìn)行擬合，得到酒精濃度的預(yù)測模型。

（3）模型驗(yàn)證

在確定的主成分?jǐn)?shù)與分割步長下，調(diào)用VAPLS算法程序，得到驗(yàn)證集的預(yù)測值，評價(jià)模型的預(yù)測效果，并與PLS建模結(jié)果比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本的拉曼光譜分析

乙醇配制不同酒精度酒樣和荔枝酒發(fā)酵過程不同時(shí)段取樣的拉曼光譜圖分別見圖1和2。由圖1和圖2可知，波數(shù)為880 cm-1及1 000～1 100 cm-1附近的特征峰分別由C-C-O面內(nèi)和面外伸縮產(chǎn)生；波數(shù)1 300 cm-1附近的特征峰由C-O-H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生；波數(shù)為1 450 cm-1附近的拉曼峰由CH3不對稱變形產(chǎn)生，而波數(shù)為2 800～3 040 cm-1拉曼峰是由—CH2，—CH3基團(tuán)的對稱/不對稱伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的[25]，波數(shù)為3 050～3 800 cm-1拉曼峰則是OH伸縮振動(dòng)峰。其中以波數(shù)為2 800～3 040 cm-1范圍內(nèi)的CH伸縮振動(dòng)特征峰最為顯著，因?yàn)榧兯胁淮嬖凇狢H基團(tuán)，所以純水的拉曼光譜在這一范圍內(nèi)沒有特征峰，波數(shù)為2 800～3 040 cm-1范圍的拉曼峰主要是乙醇的—CH伸縮振動(dòng)峰，乙醇濃度越高，振動(dòng)峰值越高。

圖1 乙醇配制不同酒精度酒樣拉曼光譜圖Fig.1 Raman spectra of samples with different alcohol contents prepared by ethanol

圖2 荔枝酒發(fā)酵過程不同時(shí)段樣品拉曼光譜圖Fig.2 Raman spectra of litchi wine samples at different fermentation stage

采用光譜軟件QSpecSuiteV1.0對各樣本原始光譜進(jìn)行2階導(dǎo)數(shù)法預(yù)處理，結(jié)果分別見圖3和圖4。由圖3和圖4可知，各樣本光譜分辨率增強(qiáng)，熒光干擾影響減小。

圖3 乙醇配制不同酒精度酒樣二階導(dǎo)光譜圖Fig.3 Second derivative spectra of samples with different alcohol contents prepared by ethanol

圖4 荔枝酒發(fā)酵過程不同時(shí)段樣品二階導(dǎo)光譜圖Fig.4 Second derivative spectra of litchi wine samples at different fermentation stage

2.2 酒精度分析模型建立

選取配制酒精溶液樣品20個(gè)（濃度為整數(shù)）用作建模校正集樣品，酒精度范圍為1%vol～20%vol，剩余配制酒精溶液樣品作為驗(yàn)證集，酒精度范圍為5.5%vol～14.5%vol，該范圍為實(shí)際發(fā)酵過程中主要的酒精度范圍。

以樣本的光譜數(shù)據(jù)矩陣作為自變量（x），而樣本的酒精度實(shí)際值作為因變量（y），對校正集各樣本原始光譜2階導(dǎo)數(shù)法預(yù)處理后，分別采用VAPLS及PLS法建立模型，兩種方法的建模結(jié)果比較見圖5。由圖5可知，PLS法建立模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.994 3，RMSE為0.447 9，VAPLS法建立模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.998 0，RMSE為0.265 9。

圖5 VAPLS及PLS法建模結(jié)果比較Fig.5 Comparison of modeling results with VAPLS and PLS method

對驗(yàn)證集樣本（濃度為非整數(shù)配制酒精）拉曼光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行2階導(dǎo)數(shù)處理后，分別采用VAPLS和PLS法所建立模型對其進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果分別見表2和表3。

由表2和表3可知，將原始光譜進(jìn)行2階導(dǎo)校正處理，并對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行夾角化后，選擇主成分?jǐn)?shù)為4，分割步長為10時(shí)建立的模型效果更佳，VAPLS預(yù)測值與真實(shí)值的絕對誤差為-0.487～0.236，相對誤差為-5%～1.6%，其相關(guān)系數(shù)R2為0.9931，RMSE為0.285 6，優(yōu)于PLS建模方法，說明VAPLS法建立的預(yù)測模型其預(yù)測能力以及穩(wěn)定性相對較好。

表2 VAPLS及PLS模型對驗(yàn)證集酒精度預(yù)測結(jié)果Table 2 Prediction results of validated collection of alcohol content with VAPLS and PLS models

表3 VAPLS及PLS模型對驗(yàn)證集酒精度預(yù)測結(jié)果分析Table 3 Analysis of prediction results of validated collection of alcohol content with VAPLS and PLS models

2.3 荔枝酒發(fā)酵過程酒精度變化預(yù)測結(jié)果

在荔枝酒發(fā)酵過程中每天取一次發(fā)酵液分別采用酒精計(jì)法及拉曼光譜法測量酒精度，共監(jiān)測兩批次。用建立的VAPLS模型，預(yù)測得到樣本的酒精度見圖6。由圖6可知，曲線充分體現(xiàn)了荔枝酒發(fā)酵過程中乙醇濃度與時(shí)間變化的關(guān)系，由于是低溫發(fā)酵，酒精度隨著發(fā)酵時(shí)間的延長緩慢上升，發(fā)酵15 d以后酒精度逐漸趨于平穩(wěn)甚至有所下降。

圖6 VAPLS模型對荔枝酒發(fā)酵過程F1（A）和F2（B）酒精度變化的預(yù)測結(jié)果Fig.6 Prediction results of alcohol content change of litchi wine during fermentation process of F1 (A) and F2 (B) by VAPLS model

拉曼光譜測量與酒精計(jì)法測量的對比結(jié)果見表4（荔枝酒發(fā)酵過程F1酒精度真實(shí)值與VAPLS模型預(yù)測值對比）和表5（荔枝酒發(fā)酵過程F2酒精度真實(shí)值與VAPLS模型預(yù)測值對比）。由表4及表5可知，建立的拉曼光譜測量方法與酒精計(jì)法測量的酒精度差異不大，可以用于快速測定荔枝酒發(fā)酵過程中發(fā)酵液的酒精度。

表4 VAPLS法對荔枝酒F1發(fā)酵過程酒精度預(yù)測結(jié)果與真實(shí)值對比Table 4 Comparison of the prediction results of alcohol content in litchi wine F1 fermentation process by VAPLS method with the real value

表5 VAPLS法對荔枝酒F2發(fā)酵過程酒精度預(yù)測結(jié)果及真實(shí)值對比Table 5 Comparison of the prediction results of alcohol content in litchi wine F2 fermentation process by VAPLS method with the real value

進(jìn)一步對發(fā)酵過程F1及F2的酒精度預(yù)測值與真實(shí)值進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表6。由表6可知，各時(shí)間段預(yù)測值均與真實(shí)值非常接近，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99以上，說明模型具有較好的預(yù)測能力及穩(wěn)定性。

表6 VAPLS法對荔枝酒發(fā)酵過程酒精度預(yù)測值與真實(shí)值相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of predicted alcohol content and true alcohol content in litchi wine fermentation process by VAPLS method

3 結(jié)論

本研究采用拉曼光譜建立荔枝酒發(fā)酵過程中酒精濃度的定量分析模型，校正集相關(guān)系數(shù)R2為0.998 0，RMSE為0.261 7，說明模型建立的方法較好；進(jìn)一步對模型進(jìn)行驗(yàn)證和評價(jià)，驗(yàn)證集中10個(gè)配制酒精溶液預(yù)測值與實(shí)際濃度的相關(guān)系數(shù)R2為0.993 1，RMSE為0.285 6，預(yù)測值與真實(shí)值的絕對誤差為-0.487～0.236，相對誤差為-5.0%～1.6%，具有較好的預(yù)測能力及穩(wěn)定性。采用VAPLS法對第一批發(fā)酵酒樣品18個(gè)拉曼光譜預(yù)測值與與氣相色譜法實(shí)測值的相關(guān)系數(shù)R2為0.996 4，RMSE為0.246 0，第二批發(fā)酵酒樣品16個(gè)拉曼光譜預(yù)測值與氣相色譜法實(shí)測值的相關(guān)系數(shù)R2為0.996 1，RMSE為0.336 5，說明模型的預(yù)測效果很好，能滿足生產(chǎn)中荔枝酒酒精度的快速檢測精度要求。因此，拉曼光譜利用2階導(dǎo)數(shù)法進(jìn)行預(yù)處理后，VAPLS構(gòu)建荔枝酒酒精度預(yù)測模型在應(yīng)用上是可行可靠的，具有良好的穩(wěn)定性。該方法不僅具有分析速度快、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，還實(shí)現(xiàn)了無損、綠色的乙醇濃度定性、定量檢測，為荔枝酒發(fā)酵過程中酒精度在線監(jiān)測及成品酒酒精度快速檢測奠定了良好的基礎(chǔ)，在發(fā)酵酒的實(shí)際生產(chǎn)過程質(zhì)量監(jiān)測具有良好的應(yīng)用前景。