寧 靜，張萬江，陳創(chuàng)夫，馬雅靜，吳江東，程 江

結(jié)核病仍舊是影響人類健康的傳染病之一，潛伏結(jié)核感染(latent tuberculosis infection，LTBI)表現(xiàn)變化多端感染缺乏特異性，中國LTBI人數(shù)多,早期診斷與預(yù)防治療刻不容緩。目前IGRA陽性是LTBI診斷指標(biāo)，IGRA用早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和培養(yǎng)濾過蛋白(CFP-10)作為特異抗原，尋找并研究新的蛋白抗原對結(jié)核病發(fā)病機(jī)制的理解及LTBI盡早發(fā)現(xiàn)診斷有重要意義。

抗原RV1737是潛伏期結(jié)核桿菌表達(dá)蛋白之一,是較好的T細(xì)胞相關(guān)候選抗原,而Th的表位對結(jié)核感染的診斷有很大潛力和優(yōu)勢，經(jīng)軟件預(yù)測并合成抗原RV1737多肽片段，進(jìn)行IGRA檢測方法的驗(yàn)證。多肽作為包被抗原建立ELISA檢測結(jié)核抗體，方法簡便快捷，一般病情越活躍、免疫應(yīng)答反應(yīng)越強(qiáng)、則抗體的陽性率會越高，進(jìn)一步探討多肽血清學(xué)診斷潛力。

1 材料與方法

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1 材料

經(jīng)DNA star、Vector NT、Bepipred分析，表位序列由強(qiáng)耀生物公司多肽技術(shù)平臺合成。序列的理化性質(zhì)見表1。用ABC表示，對照抗原D為融合抗原 ESAT6-CFP10。

表1 多肽序列和理化性質(zhì)

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2 樣本納入

多肽誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的全血樣本納入：來自石河子大學(xué)附屬醫(yī)院感染科、呼吸科，分別分為3組：結(jié)核組(tuberculosis，TB)樣本共24例，診斷符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》中標(biāo)準(zhǔn): 影像學(xué)檢查+結(jié)核中毒臨床癥狀+實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)+抗結(jié)核治療有效的人群；LTBI組樣本18例，符合《WS196-2017結(jié)核病分類》的新增分組標(biāo)準(zhǔn)：為無免疫缺陷者測PPD大于10 mm或IGRA陽性者；對照組(healthy control，HC)樣本17例來自健康體檢人群，所有入選者均自愿參與研究，知情同意后采樣，符合醫(yī)學(xué)倫理規(guī)范。多肽建立間接ELISA，血清樣本納入：TB組，取患者血清作為陽性樣本，共65例；HC組，取健康體檢者血清為陰性樣本110例。

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3 實(shí)驗(yàn)步驟

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多肽誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測 ① 新鮮全血采集與保存：血液約5 ml存儲于室溫環(huán)境4～6 h分裝處理。多肽A、B、C，融合抗原ESAT-6/CPF-10(抗原D)加入分裝樣本，37 ℃孵育22 h，3 000 r/min，離心5 min取上清液。② IFN-γ檢測：依試劑盒流程，450 nm上機(jī)檢測，OD值計(jì)算IFN-γ濃度(pg/ml)。

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多肽建立間接ELISA ① 多肽 A、B、C 用了碳酸鹽緩沖液稀釋，加入 96 孔板，100 μg/ml 孔，一抗：血清樣本(1∶20，1∶50，1∶100稀釋)，二抗：HRP標(biāo)記羊抗人 IgG(1∶5 000，1∶10 000，1∶10 000稀釋)，確定最佳血清一抗?jié)舛仍?∶100稀釋，450 nm吸光度最佳。② 確定了最佳包被及抗體的濃度，采用棋盤滴定法，P/N值(檢測得到OD值后陽性血清與陰性血清的相應(yīng)比值)大于2.1有診斷意義，多肽A、B、C包被濃度分別是0.5 μg/ml、0.2 μg/ml和0.5 μg/ml。③ ELISA方法的可靠性驗(yàn)證，批內(nèi)實(shí)驗(yàn)與批間實(shí)驗(yàn)，變異系數(shù)均<15%，重復(fù)性在可接受范圍。其后檢測不同組血清。④ 組間的不同多肽的ROC曲線的繪制。

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4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0繪圖，SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩獨(dú)立樣本Mann-Whitney檢驗(yàn)，多樣本比較Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，

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<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同多肽抗原對全血刺激后釋放IFN-γ水平

經(jīng)多肽A、B、C和抗原D刺激后，LTBI組與TB組IFN-γ水平均明顯高于HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.001)。經(jīng)多肽A、B、C作用后，LTBI組IFN-γ水平明顯高于TB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，抗原D在LTBI與TB組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 不同多肽抗原對全血刺激后釋放IFN-γ水平

2.2 LTBI組與TB組ROC曲線評估抗原的診斷價(jià)值

多肽A、B、C之間的特異性與靈敏度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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>0.05)；A+B+C聯(lián)合組的靈敏度明顯高于多肽A、B、C與融合D，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)。見表2。

表2 LTBI組與TB組的IFN-γ值的ROC曲線數(shù)據(jù)

2.3 多肽抗原在陽性和陰性血清中IgG測定與散點(diǎn)圖

TB組中多肽A的IgG抗體吸光度明顯大于多肽B、C，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)，而HC組中多肽A的IgG抗體吸光度明顯小于多肽B、C(圖2)。HC組中多肽A、B、C的IgG抗體吸光度均值分別為0.448 8、0.527 7、0.578 5，分別明顯低于TB組的1.139 1、0.915 2、0.781 9，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)。見圖3。

圖2 HC組與TB組中不同多肽的抗體IgG分布

圖3 HC與TB組中同種多肽檢測血清抗體IgG吸光度值分布

2.4 不同多肽在HC組與TB組血清中IgG抗體分布與ROC的繪制

HC組與TB間繪制多肽A、B、C的ROC，分別為0.908、0.847和0.752。多肽A的ROC較高，提示多肽A診斷效能可能優(yōu)于多肽B和多肽C。聯(lián)合多肽的曲線面積與單一面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)。見圖4。提示聯(lián)合多肽診斷曲線面積與特異性上升。單獨(dú)多肽A、B、C測定結(jié)核抗IgG 的特異性是83.6%、69.1%、43.6%，靈敏度是87.7%、89.2%、86.2%。聯(lián)合使用A+B+C多肽，特異性是92.7%，靈敏度是67.7%。若抗體均是陽性為陽性結(jié)果，有一個(gè)陰性為陰性結(jié)果，則不同抗原組合檢測結(jié)核抗IgG 特異性、靈敏度，陰陽性結(jié)果分布的例數(shù)情況。見表3。

表3 不同多肽及組合后相關(guān)實(shí)驗(yàn)診斷指標(biāo)

圖4 HC與TB組間不同多肽檢測抗體 IgG 吸光度繪制ROC曲線

3 討論

中國結(jié)核病疫情呈現(xiàn)“三高一低”(感染率高、患病率高、農(nóng)村疫情高、年遞減率低)的態(tài)勢，新疆省發(fā)病率位居前列。中國發(fā)病率逐年遞降而結(jié)核治療率無顯著線性變化，若無更強(qiáng)防治措施難達(dá)到 WTO 的 2035 年終止結(jié)核病戰(zhàn)略目標(biāo)。結(jié)核分枝桿菌感染主要是“帶菌免疫”，以細(xì)胞免疫機(jī)制為主，感染的演變也是多因素的。結(jié)核感染檢測金標(biāo)準(zhǔn)為抗酸染色后結(jié)核菌痰涂片和細(xì)菌培養(yǎng)。結(jié)核菌素試驗(yàn)(TST)采用純蛋白衍生物(puriied protein derivative, PPD)檢測，方法簡易，可能高估潛伏感染率，IGRA陽性可被認(rèn)為是潛在感染的指標(biāo)。目前廣泛應(yīng)用的IGRAs商品化試劑有：QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-IT)和T-SPOT.TB(T-SOPT)，有檢測成本較高、操作相對復(fù)雜的特點(diǎn)，IGRA對活動(dòng)性和非活動(dòng)性的結(jié)核均有檢出能力，在臨床診斷和療效評價(jià)方面的意義仍需探討。以LTBI時(shí)高表達(dá)蛋白抗原RV1737為切入點(diǎn)，此抗原在LTBI產(chǎn)生較高水平免疫反應(yīng)。RV1737多肽為基礎(chǔ)的IGRA檢測，在不同結(jié)核感染狀態(tài)組檢測多肽刺激后IFN-γ，與對照融合蛋白ESAT-6/CFP-10刺激后IFN-γ釋放量相比高低差異大。聯(lián)合多肽診斷繪制ROC曲線面積比起單一抗原面積增加。多肽對ATB與LTBI有區(qū)分作用，有診斷LTBI候選抗原潛力。

應(yīng)用RV1737多肽為包被抗原建立間接ELISA，檢測結(jié)核IgG抗體在TB血清組有較高反應(yīng)性，多肽A效果突出，觀察在多肽組合后情況下結(jié)核IgG特異性有所提高。有文獻(xiàn)指出高度疑似結(jié)核病的患者痰涂片聯(lián)合抗體檢測會降低漏診率和誤診率的發(fā)生，一般認(rèn)同抗體產(chǎn)生的多少與疾病的活動(dòng)程度呈正相關(guān)。多肽的血清學(xué)檢測對于疑似結(jié)核感染可能有排篩意義。間接ELISA是常用檢測抗體的方法，包被抗原特異性越強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)整體特異性和穩(wěn)定性會提高，多肽作為包被抗原提升檢測的特異性，成本減低且方法便于掌握。人為因素也會對檢測干擾，嚴(yán)格規(guī)范步驟與操作，吸光度值測量等環(huán)節(jié)都是必要的。