凌 益，徐 暉，黃 穎，任妮娜，唐 芳，姚血明，陸道敏，馬武開

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種侵蝕性多關(guān)節(jié)炎為主要癥狀的自身免疫性疾病。RA中國大陸發(fā)病率為0.42%，患病人群約500萬，男女患病比率約為1∶4。RA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，姜黃-白芍藥對(duì)具有破血行氣，通經(jīng)止痛的功效，其是治療RA的常用中藥?，F(xiàn)代藥理研究表明姜黃、白芍均可通過抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等途徑治療RA。因成分多、作用復(fù)雜，姜黃、白芍各自的單體研究不能確切體現(xiàn)該藥對(duì)防治RA的功效。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以生物信息數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，綜合藥理學(xué)和生物活性等學(xué)科的知識(shí)和方法，探討藥物作用于疾病的可能機(jī)制。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分析手段，探索姜黃-白芍治療RA可能的協(xié)同機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 姜黃-白芍活性成分的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php/)分別檢索“姜黃”、“白芍”，獲得2味中藥所有化合物成分。根據(jù)各化合物ADME(吸收、分布、代謝、排泄)性質(zhì)的結(jié)果，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和藥物相似度(drug likeness，DL)作為化合物成分的篩選條件，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18篩選出姜黃、白芍活性化合物。此外，將已明確具有防治RA作用，但不滿足OB和DL條件的化合物同樣納入姜黃-白芍的活性化合物中。

1.2 姜黃-白芍活性成分靶點(diǎn)的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)活性成分獲取相應(yīng)靶蛋白，將獲得靶蛋白輸入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniport.org/)檢索，得到標(biāo)準(zhǔn)化基因名。另外，將活性成分輸入PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中查詢其對(duì)應(yīng)的SMILES，在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)輸入活性成分的SMILES，獲得活性成分的靶蛋白及基因名。將上述兩個(gè)數(shù)據(jù)庫獲得的靶蛋白結(jié)果取并集，即為相應(yīng)活性成分的靶蛋白，并整理為相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化基因名。將篩選出姜黃、白芍活性成分及相應(yīng)的靶蛋白基因輸入Cytoscape 3.7.1軟件中，構(gòu)建出藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)；然后使用network analyzer功能進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析，根據(jù)degree的數(shù)值，預(yù)測該節(jié)點(diǎn)的重要性。

1.3 RA靶點(diǎn)基因的篩選

在GeneCards數(shù)據(jù)庫、人類基因和基因表型綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)、比較毒物遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(the comparative toxicogenomics database，CTD)中檢索關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”，獲取RA的疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并將靶點(diǎn)在UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化基因名。

1.4 藥物有效成分和RA疾病共同靶點(diǎn)篩選

將姜黃-白芍藥對(duì)有效成分靶基因和RA疾病靶基因同時(shí)錄入VENNY 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在線作圖案軟件，進(jìn)行映射后構(gòu)建韋恩圖，得到姜黃靶基因、白芍靶基因及RA靶基因相互間的交集基因，其中它們?nèi)咧g共同的交集基因是姜黃-白芍藥對(duì)有效成分和RA聯(lián)系的靶點(diǎn)基因，其可能是姜黃-白芍藥對(duì)發(fā)揮協(xié)同治療的節(jié)點(diǎn)。

1.5 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用STRING數(shù)據(jù)庫在線軟件(https://string-db.org/)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型。選擇Mutiple Protein，將三者間交集基因輸入，蛋白種屬選人類即“Homo sapiens”，最低相互作用閾值選定為中等“medium confidence(0.400)”，其他參數(shù)均保持默認(rèn)設(shè)置，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，利用Cytoscape 3.7.1軟件繪制相互作用網(wǎng)路，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.6 姜黃-白芍藥對(duì)對(duì)RA靶點(diǎn)作用的生物過程富集及通路富集

利用Cytoscape 3.7.1中的CluoGo插件，對(duì)三者間共同交集基因進(jìn)行京都基因(geneontology，GO)生物學(xué)過程富集分析，對(duì)姜黃與RA交集基因和白芍與RA交集各自進(jìn)行基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG)通路富集分析，物種選為“Homo sapiens”，以

P

<0.05作為顯著功能和通路的臨界值，獲取相應(yīng)數(shù)據(jù)，以條形圖和氣泡將其可視化。

2 結(jié)果

2.1 姜黃-白芍活性成分和相應(yīng)靶點(diǎn)

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共獲取有137個(gè)化合物，其中52個(gè)屬于姜黃，85個(gè)屬于白芍。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為條件篩選活性化合物，姜黃共篩選到3個(gè)活性化合物，白芍共篩選到12個(gè)活性化合物。經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，具有明確防治RA的Demethoxycurcumin(去甲氧基姜黃素)、Ar-turmerone(芳姜黃酮)、Curcumin(姜黃素)3個(gè)化合物雖然不滿足上述ADME篩選條件，但是仍將其歸入姜黃的活性化合物，故姜黃活性化合物共6個(gè)。最終獲得姜黃活性化合物6個(gè)，白芍活性化12個(gè)，即姜黃-白芍藥對(duì)共18個(gè)潛在活性化合物，其基本信息見表1。根據(jù)18個(gè)潛在活性化合物，在TCMSP數(shù)據(jù)庫和SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫經(jīng)相應(yīng)檢索后，刪除重復(fù)靶點(diǎn)蛋白和非人類靶點(diǎn)蛋白，共獲得姜黃-白芍靶點(diǎn)蛋白445個(gè)，其中278個(gè)屬于姜黃，290屬于白芍，重復(fù)123個(gè)。其中化合物N15、N16、N17、N18目前無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白，故從活性成分中剔除。

表1 符合篩選標(biāo)準(zhǔn)OB和DL的活性化合物表

利用Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建出藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖1。其中矩形分別代表藥物，菱形分別代表姜黃、白芍各自的活性成分，橢圓形分別代表為姜黃單獨(dú)靶點(diǎn)、姜黃-白芍共有靶點(diǎn)和白芍單獨(dú)靶點(diǎn)，邊代表藥物、活性成分和靶蛋白的相互作用。該圖中節(jié)點(diǎn)共460個(gè)，平均degree為3.861。其中活性成分中degree值排名前三成分為Kaempferol(山奈酚)、Curcumin、Demethoxycurcumin，其degree值分別為166、109、100，它們可能為姜黃-白芍藥對(duì)治療疾病的主要成分。靶點(diǎn)蛋白基因degree數(shù)值較高的基因?yàn)镃YP19A1、PGR、NR3C1、SHBG、ESR1、AR、NCOA2，表明姜黃-白芍藥對(duì)可能主要作用于上述關(guān)鍵靶點(diǎn)基因發(fā)揮藥物療效。該網(wǎng)絡(luò)體現(xiàn)了一個(gè)活性成分可對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)蛋白，一個(gè)靶點(diǎn)蛋白可對(duì)應(yīng)多個(gè)活性成分，姜黃-白芍藥對(duì)防治疾病是個(gè)復(fù)雜的過程。

圖1 藥對(duì)-活性成分-靶點(diǎn)蛋白基因網(wǎng)絡(luò)

2.2 RA基因與姜黃-白芍藥對(duì)基因的交集

通過查詢上述3個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫得到RA相關(guān)基因2 060個(gè)，利用UniProt數(shù)據(jù)將相關(guān)基因標(biāo)準(zhǔn)化。將姜黃、白芍各自活性成分靶蛋白基因與RA基因輸入VENNY 2.1在線作圖案軟件，姜黃與RA共有98個(gè)交集基因，白芍與RA共有136個(gè)交集基因，姜黃、白芍、RA三者共有53個(gè)交集基因，所得韋恩圖見圖2。三者共同交集基因列表見表2。利用Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建出藥物-有效成分-靶點(diǎn)基因-疾病的網(wǎng)絡(luò)，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)表明姜黃-白芍藥對(duì)可能通過Stigmasterol(植物甾醇)、Campesterol(菜油甾醇)、CLR(膽固醇)、Demethoxycurcumin、Ar-turmerone、Curcumin、Mairin(白樺脂酸)、Beta-sitosterol(beta-谷甾醇)、Sitosterol(谷甾醇)、Kaempferol、(+)-catechin(兒茶素)、Palbinone(芍藥二酮)、Paeoniflorin(芍藥苷)這13個(gè)活性成分，對(duì)53個(gè)靶點(diǎn)蛋白反應(yīng)，協(xié)同RA的治療。

圖2 藥物靶點(diǎn)蛋白基因-疾病基因的韋恩圖

圖3 藥物-有效成分-靶點(diǎn)基因-疾病網(wǎng)絡(luò)

表2 藥對(duì)活性成分作用基因與RA基因交集表

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析

53個(gè)交集基因構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。其中網(wǎng)絡(luò)圖共有53個(gè)節(jié)點(diǎn)，277個(gè)邊，degree值越大，則節(jié)點(diǎn)越大，填充顏色越深。將degree值大于16的基因繪制柱狀圖，見圖5。其中degree數(shù)值較大排名前三的基因?yàn)锳KT1、TNF、PTGS2，表明姜黃-白芍藥對(duì)主要通過上述3個(gè)基因?qū)A起協(xié)同治療作用。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 基因與degree柱狀圖

2.4 GO富集和KEGG富集分析

將篩選得到的53個(gè)靶基因進(jìn)行GO和KEGG通路分析。設(shè)定閾值

P

<0.05，選取靠前的富集結(jié)果，對(duì)生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組分(cellular component，CC)進(jìn)行分析。靶基因在BP富集過程有194個(gè)，選取Pvalue最小的10生物過程作圖，見圖6，主要表現(xiàn)在炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)(regulation of inflammatory response)、核受體活性(nuclear receptor activity)、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)、類固醇激素受體活(steroid hormone receptor activity)、小分子代謝過程正向調(diào)節(jié)過程(positive regulation of small molecule metabolic process)等生物過程。靶點(diǎn)基因在MF富集過程有30個(gè)，選取Pvalue最小的10生物過程作圖，見圖7，主要表現(xiàn)在配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性(ligand-activated transcription factor activity)、類固醇結(jié)合(steroid binding)、單加氧酶活性(monooxygenase activity)、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性(nitric-oxide synthase regulator activity)等分子功能。靶點(diǎn)基因在CC富集過程僅有1個(gè)，為核封套管腔(nuclear envelope lumen)。姜黃與RA交集基因姜黃基因KEGG通路富集為28條通路，白芍與RA交集基因KEGG通路富集為74條通路，它們共有24條通路重疊，這24條重疊的通路可能為姜黃、白芍起協(xié)同作用的通路，作氣泡圖(以基因數(shù)與總基因數(shù)比值為橫坐標(biāo)，基因數(shù)越多點(diǎn)越大，

P

值越小顏色越深)，結(jié)果見圖8。上述結(jié)果表明姜黃-白芍協(xié)同治療RA涉及生物過程、分子功能和細(xì)胞組分及通路過程中，它可能為多成分、多靶點(diǎn)、多通路的1個(gè)復(fù)雜的生化過程。

圖6 藥對(duì)治療RA的BP富集分析

圖7 藥對(duì)治療RA的MF富集分析

圖8 藥對(duì)治療RA的KEGG通路

3 討論

從藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，姜黃-白芍藥對(duì)對(duì)RA治療具有協(xié)同作用的活性成分有13個(gè)，以姜黃素、去甲氧基姜黃素、山奈酚為主。其中，姜黃素的活性氧清除功能是通過調(diào)控環(huán)氧合酶(COX)和核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)發(fā)揮抗氧化作用，下調(diào)氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎性反應(yīng)，或者通過核轉(zhuǎn)錄因子、Toll樣受體4(toll-like receptor 4，LR4)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Erk1/2)等途徑調(diào)節(jié)白介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、髓樣分化初級(jí)應(yīng)答蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等抑制炎性反應(yīng)，還能活化通路磷脂酰肌醇3-激酶/第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白/蛋白激酶B(PI3K/AKT/mTOR)通路，抑制環(huán)氧化酶-2(COX-2)和B細(xì)胞淋巴瘤因子2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，最終姜黃素通過多途徑改善RA。去甲氧基姜黃素為姜黃素的衍生物，可抑制IL-1、TNF-α等炎性因子釋放，調(diào)節(jié)胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，緩解RA癥狀，或下調(diào)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9表達(dá)，減少Ⅳ型膠原降解，抑制滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲能力。山奈酚屬于黃酮類物質(zhì)，一方面具有抗氧化應(yīng)激功能，減少氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎性反應(yīng)的發(fā)生，另一方面能通過線粒體凋亡通路和PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)RA相關(guān)細(xì)胞凋亡。故姜黃-白芍藥對(duì)的多個(gè)有效成分可以通過抗氧化、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種途徑對(duì)RA發(fā)揮作用。

從PPI網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，姜黃-白芍藥對(duì)對(duì)RA起治療作用的基因中，自由度最高的前三靶點(diǎn)為AKT1、TNF、PTGS2。AKT1是蛋白激酶(AKT)的3種亞型之一，是多條信號(hào)通路的一個(gè)重要交叉點(diǎn)，可被激素、生長因子、細(xì)胞因子、細(xì)胞間基質(zhì)等物質(zhì)活化，活化的AKT引起下游磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)和靶蛋白之間的相互作用，如AKT活化作用于Bcl-2、Caspases-9與細(xì)胞凋亡相關(guān)，AKT活化作用于mTOR與自噬相關(guān)，AKT活化參與TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-22的表達(dá)，AKT與滑膜細(xì)胞生長、增殖、凋亡、自噬、遷移等多種細(xì)胞活動(dòng)和生物學(xué)效應(yīng)相關(guān)，直接或間接影響RA。TNF與RA相關(guān)研究最多的為TNF-α，TNF-α與其受體(TNFRs)形成的TNF-TNFRs系統(tǒng)不僅能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還能促進(jìn)細(xì)胞增值、分化、成熟，TNF-TNFRs系統(tǒng)失衡與RA發(fā)生密切相關(guān)。此外，TNF-α經(jīng)NF-κB等途徑產(chǎn)生炎性因子、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、MMPs導(dǎo)致炎性反應(yīng)、血管翳形成、骨質(zhì)破壞也是RA進(jìn)展的原因。PTGS2即COX-2，前列腺素(PG)的合成隨著降低COX-2活性降低而減少，PG在滑膜組織中主要源于RA滑膜，并且引起RA的疼痛。故姜黃-白芍可以通過AKT1、TNF、PTGS2等靶向共同調(diào)節(jié)RA治療。

從富集分析表明，姜黃-白芍藥對(duì)在RA治療是配體激活轉(zhuǎn)錄因子、類固醇、單加氧酶、一氧化氮合酶等物質(zhì)對(duì)炎性反應(yīng)、核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、小分子代謝過程等生物過程的調(diào)節(jié)，涉及細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞核的一個(gè)復(fù)雜的過程。KEGG通路富集分析表明，癌癥相關(guān)通路、糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路，缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路，TNF信號(hào)通路，IL-17信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路涉及藥對(duì)治療RA。研究表明RA成纖維樣細(xì)胞異常增生，并展現(xiàn)出了類癌細(xì)胞特點(diǎn)，RA成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞異常增生可能與癌癥相關(guān)通路有關(guān)聯(lián)，該藥對(duì)可通過癌癥相關(guān)通路對(duì)RA發(fā)揮治療作用。糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號(hào)通路與氧化應(yīng)激反應(yīng)相互作用，活化NF-κB，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，在RA形成中扮演重要角色。在HIF-1信號(hào)通路中，HIF-1能夠介導(dǎo)Th1和Th17 細(xì)胞的生成，導(dǎo)致一些列炎性反應(yīng)。TNF信號(hào)通路，IL-17信號(hào)通路中，受體相互作用蛋白經(jīng)各種通路介導(dǎo)炎癥發(fā)生。由此可推測，姜黃-白芍通過抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎性反應(yīng)，改善機(jī)體免疫功能和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等機(jī)制協(xié)同治療RA。