張鶴松，張傳海，馬金良，莢衛(wèi)東，余繼海

腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是肝癌患者預(yù)后不佳最主要的特征，該過程涉及很多內(nèi)外因素。肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的肝癌形式，占所有原發(fā)性肝癌的85%～90%。最新數(shù)據(jù)顯示全球肝癌年新發(fā)及死亡病例數(shù)分別居于惡性腫瘤第6位和第2位。高發(fā)病率及病死率說明現(xiàn)有的手段無法對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移患者根治，基于此，該研究希望尋找一個新的藥物靶點治愈遠處轉(zhuǎn)移的病灶，為后期根治性切除提供契機。鞘氨醇-1-磷酸轉(zhuǎn)運體(sphingosine-1-phosphate transporter 2，SPNS2)是目前腫瘤研究的一個熱點，它是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)轉(zhuǎn)運體之一，具有504個氨基酸殘基組成的跨膜蛋白。多項研究表明斑馬魚SPNS2缺失造成心裂的作用，后續(xù)研究表明其參與淋巴調(diào)節(jié)、血管形成和免疫調(diào)節(jié)等功能。近年來，有研究表明SPNS2的表達異常和腫瘤的進展相關(guān)，在肺癌、胃癌、結(jié)腸癌等中相繼開展了一系列與腫瘤相關(guān)研究，其中在胃癌研究上，有學者提出SPNS2與上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)相關(guān)，但在HCC進展過程中，SPNS2與EMT相關(guān)的研究較少。因此，該研究探討SPNS2在HCC上表達情況與EMT之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

2018年1月—2019年12月，收集了10例在安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院肝臟外科行手術(shù)切除的HCC患者新鮮癌及癌旁組織(距離癌組織1 cm以上)，同時選取存放在安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院病理科行肝癌手術(shù)的70例組織標本，年齡在24～87(58.10±11.43)歲，其中男性44例，女性26例。術(shù)前均未接受抗腫瘤治療，并且與患者或家屬進行了充分溝通和簽署了實驗知情同意書。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher公司)；RT-PCR試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)；β-Actin、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)(中國Zs-BIO公司)；SPNS2(英國Abcam公司)；N-鈣黏蛋白(N-cadherin)(上海Santa Cruz公司)。

1.3 方法

1

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3

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1

免疫組化 手術(shù)中取下的標本切片厚5 μm，3次依次過二甲苯脫蠟、濃度梯度乙醇水化洗去乙醇，在抗原高壓修復(fù)后，3%過氧化氫室溫下孵育20 min，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌3次，加一抗(濃度分別為E-cadherin，1∶100，N-cadherin，1∶100，SPNS2，1∶200)，37 ℃孵育60 min，PBS洗滌3次。加二抗，37 ℃孵育20 min；PBS洗滌，甩干，加DAB顯色劑，顯微鏡下控制顯色時間(有陽性終止顯色)，蘇木精復(fù)染1 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，水洗，碳酸鋰藍化1 min，水洗，常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢。

1

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3

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2

RT-PCR 組織樣品加入TRIzol勻漿后參照RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，定量根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序：65 ℃，5 min；42 ℃，60 min；70 ℃，5 min。反應(yīng)產(chǎn)物即為cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ陨鲜龇磻?yīng)產(chǎn)物為模板，ABI 7500型RT-PCR循環(huán)條件如下：95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，設(shè)置循環(huán)數(shù)為40，檢測各目的基因Ct值。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2法分析各基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1

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3

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3

Western blot實驗 每100 mg組織加入RIPA(強)細胞裂解液1 ml進行冰上勻漿操作，提取組織總蛋白，按照1∶4加入5× SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱10 min，冷卻后樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，每孔30 μg樣本。濃縮膠所用電壓為80 V，時間為30 min；分離膠所用電壓為120 V，時間為1 h。蛋白300 mA恒流轉(zhuǎn)膜;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，應(yīng)用濃度為5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜3 min。分別參考抗體說明書進行抗體稀釋，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光、顯影，以β-Actin為內(nèi)參，分析各指標的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 26.0軟件進行分析，肝癌及癌旁組織表達情況及病理特征采用χ檢驗，癌及對應(yīng)癌旁組織mRNA和蛋白水平差異采用獨立樣本

t

檢驗，

P

<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌及癌旁組織HE染色情況

在HE染色400倍的視野下肝癌組織較對應(yīng)癌旁組織細胞異型性明顯，核大深染，易見異型核分裂像，間質(zhì)血管豐富(圖1)。

圖1 HE染色結(jié)果 ×400

2.2 SPNS2、N-cadherin、E-cadherin蛋白癌及癌旁組織的表達情況

根據(jù)免疫組化結(jié)果，SPNS2蛋白陽性信號主要定位于細胞膜，通過DAB顯色后，將細胞膜呈現(xiàn)棕黃色判別為陽性表達。SPNS2、N-cadherin、E-cadherin在癌及對應(yīng)癌旁組織差異有統(tǒng)計學意義，其中SPSN2在癌組織中陽性率(60%，42/70)，而在癌旁組織中陽性率為(27.1%，19/70)，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。見表2和圖2。

表2 SPNS2、E-cadherin、N-cadherin在肝癌組織和癌旁組織表達情況

圖2 肝癌及癌旁組織中SPNS2、E-cadherin和N-cadherin的表達 SP×400

2.3 SPNS2與臨床病理特征之間的關(guān)系

評估SPNS2與臨床病理特征之間的關(guān)系，如表3所示，SPNS2基因與年齡、性別、分化程度差異無統(tǒng)計學意義。而與肝癌TNM分期和微血管侵犯差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。

表3 SPNS2與臨床病理特征之間的關(guān)系

2.4 SPNS2在肝癌組織及癌旁組織中mRNA和蛋白的表達水平

RT-PCR 和 Western blot檢測結(jié)果均表明，與癌旁組織比較，癌組織中SPNS2蛋白表達均顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=4.474，

P

<0.01；

t

=14.015，

P

<0.01)，其中Western blot結(jié)果還顯示在癌組織中N-cadherin水平升高，E-cadherin水平降低，對應(yīng)癌旁組織相反，差異有統(tǒng)計學意義(

t

=10.783，

P

<0.01；

t

=13.200，

P

<0.01)。見圖3。

圖3 SPNS2、N-cadherin、E-cadherin的表達情況

3 討論

HCC是肝癌最常見類型，在過去30年中，HCC的發(fā)病率一直在上升。雖然外科手術(shù)是HCC的重要手段，但是肝細胞癌幾乎總是在慢性炎癥的肝臟中發(fā)展，因此，需要綜合治療。在研究HCC的機制時，鑒定新的有效的治療靶點十分必要。

SPNS2是一種重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白，利用細胞膜內(nèi)外濃度差異造成的電化學勢能來轉(zhuǎn)運底物，并參與免疫調(diào)節(jié)、炎癥誘導和血管生成。另外，SPNS2在不同的腫瘤類別和微環(huán)境中，其作用也不一致。在小細胞肺癌中，SPNS2基因敲減后促進腫瘤的遠處定植；在胃癌和結(jié)腸癌中，SPNS2基因過表達能促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。該研究中，通過RT-PCR和Western blot實驗結(jié)果顯示SPNS2在HCC癌組織中蛋白和mRNA表達水平較癌旁組織上升，提示SPNS2在HCC中可能是促癌基因。通過免疫組織化學法進一步研究顯示SPNS2蛋白陽性信號主要定位于細胞膜，在HCC癌組織中的陽性率高達60%，而在癌旁組織中的陽性率只有27.1%，該結(jié)果顯示SPNS2和HCC可能相關(guān)，還提示了SPNS2是個跨膜蛋白，其表達異?？赡芤鸺毎螒B(tài)改變或黏附能力下降。

研究表明EMT是腫瘤進展中的重要的一個環(huán)節(jié)，涉及多個轉(zhuǎn)錄因子參與，其中E-cadherin和N-cadherin是典型的細胞黏附分子，其表達下調(diào)或上升可使細胞的黏附能力發(fā)生改變。上述通過免疫定位提示SPNS2是膜蛋白，其表達異常可能使腫瘤細胞黏附能力下降，進一步推測SPNS2可能誘導EMT的發(fā)生從而促進HCC的進展。因而，選取了E-cadherin和N-cadherin兩個典型的黏附分子，免疫組織化學和Western blot實驗結(jié)果顯示HCC癌組織中E-cadherin表達下降，N-cadherin表達上升。兩種實驗結(jié)果改變方向均和EMT進程一致，使腫瘤細胞的黏附能力下降。

最后該課題結(jié)合臨床樣本數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，年齡、性別、分化程度與SPNS2差異無統(tǒng)計學意義，與腫瘤TNM分期和血管侵犯等病理特征密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義。臨床分期較晚和血管侵犯是評估HCC患者預(yù)后不良的關(guān)鍵因素，分析SPNS2與HCC患者病理數(shù)據(jù)之間的關(guān)系具有實際意義，為患者預(yù)后提供參考意見，也表明了SPNS2具有現(xiàn)實研究價值。

綜上所述，該研究表明了SPNS2在HCC中存在差異性表達，并且和臨床病理特征相關(guān)，可能通過調(diào)控EMT發(fā)生促進HCC進展而發(fā)揮促癌基因的作用。因此，后期該課題組將從細胞水平，進一步研究SPNS2影響HCC的EMT現(xiàn)象發(fā)生的相關(guān)機制。