龍若庭，陳淑霞，林萃，羅華玉，李戀湘，李淑娜

珠海市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東珠海 519001

當(dāng)個(gè)體內(nèi)存在兩種或兩種以上不同核型的細(xì)胞系時(shí)，稱為嵌合體。研究［1-2］發(fā)現(xiàn)，嵌合體中異常核型比例越高，細(xì)胞畸變發(fā)生越早，致畸越嚴(yán)重，臨床癥狀越明顯。因此，嵌合體是導(dǎo)致胎兒出生缺陷的常見原因之一。嵌合體的檢測需經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和繁瑣制片染色過程，檢測比較耗時(shí)，且其對＜5 Mb的染色體片段分辨率較低，所以小片段染色體異常的臨床檢測存在局限性。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，QFPCR）技術(shù)可通過擴(kuò)增染色體上短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）位點(diǎn)來比較遺傳物質(zhì)的拷貝數(shù)，判斷相應(yīng)染色體的數(shù)目，提高檢測的靈敏度，加快檢測進(jìn)度，緩解產(chǎn)前孕婦的心理壓力，目前在臨床產(chǎn)前檢驗(yàn)中的應(yīng)用越來越廣泛［3-9］。目前臨床常用的非整倍體QFPCR試劑盒主要針對常見的13、18、21、X及Y染色體，通過分別設(shè)計(jì)引物，可同時(shí)檢測多個(gè)STR位點(diǎn)，測算染色體上基因位點(diǎn)的拷貝數(shù)。但檢測中應(yīng)用PCR檢測STR位點(diǎn)，對于低比例數(shù)目異常嵌合體的檢測仍存在一定局限性，易造成漏診［10-12］。我們抽取1例胎兒唐氏篩查（以下簡稱唐篩）18三體高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦產(chǎn)前羊水細(xì)胞，采用QF-PCR法多個(gè)非整倍體試劑盒及X染色體STRs位點(diǎn)檢測試劑盒檢測STRs基因拷貝數(shù)，并分析其染色體核型，旨在為嵌合體的遺傳學(xué)分析及產(chǎn)前診斷提供更多的數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者，女，34歲，因胎兒唐篩18三體高風(fēng)險(xiǎn)于2020年10月就診于我院產(chǎn)前診斷中心。孕21+1周，就診時(shí)無發(fā)熱、腹痛、陰道流血、流水等癥狀；否認(rèn)家族遺傳病史及不良生育史。本研究通過了珠海市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，符合《赫爾辛基宣言》要求。

1.2 孕婦羊水細(xì)胞X染色體STRs相關(guān)點(diǎn)位基因拷貝數(shù)檢測 ①DNA抽提：取500μL羊水于EP管，5 000 rpm/min離心5 min，棄上清，沉淀中加入生理鹽水1 mL，顛倒混勻后，5 000 rpm/min離心5 min，棄上清，在沉淀中加入8%chelex 10 060μL、10 mg/L的蛋白酶K 5μL，振蕩混勻，56℃溫浴2 h。100℃變性10 min，13 000 rpm/min離心10 min，取上清作為DNA模板備用。②染色體非整倍體QF-PCR檢測：采用達(dá)瑞非整倍體檢測試劑盒（廣州達(dá)瑞生物，LOT：202002）檢測X染色體STR18三體綜合征相關(guān)位點(diǎn)拷貝數(shù)。取羊水DNA 2μL作為模板。按說明書配置擴(kuò)增體系（10μL），在ABI9700基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行STR擴(kuò)增。循環(huán)條件：95℃5 min；95℃30 s，58℃40 s，72℃50 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃60 min。擴(kuò)增結(jié)束后在ABI3500DX遺傳分析儀（美國ABI公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，結(jié)果用GeneMapper ID-X 1.0軟件（美國ABI公司）GeneMapper ID-X 1.0軟件（美國ABI公司）。③采用Devyser緊湊型V3試劑盒（瑞典，LOT：19I144）檢測X染色體上7個(gè)性別染色體STR位點(diǎn)，評估X染色體上遺傳信息拷貝數(shù)。取羊水DNA 1μL作為模板。按說明書配置擴(kuò)增體系（10μL），在ABI9700基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行STRs擴(kuò)增。循環(huán)條件：95℃15 min；94℃30 s，58℃90 s，72℃190 s，共27個(gè)循環(huán)；72℃30 min；4℃。擴(kuò)增結(jié)束后在ABI3500DX遺傳分析儀（美國ABI公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，結(jié)果用GeneMapper IDX 1.0軟件（美國ABI公司）GeneMapper ID-X 1.0軟件（美國ABI公司）。④采用AGCU 19X-STR多重?zé)晒鈴?fù)合擴(kuò)增試劑盒（無錫中德美聯(lián)，LOT：2007073）對19X-STRs進(jìn)行擴(kuò)增，分析X染色體STRs位點(diǎn)信息。取羊水DNA 1μL作為模板。按AGCU 19XSTR多重?zé)晒鈴?fù)合擴(kuò)增試劑盒說明書配置擴(kuò)增體系，并編制擴(kuò)增程序。擴(kuò)增在ABI9700基因擴(kuò)增儀上（美國ABI公司）進(jìn)行，擴(kuò)增后用ABI3500DX遺傳分析儀（美國ABI公司）進(jìn)行毛細(xì)管電泳，GeneMapper ID-X 1.0軟件（美國ABI公司）。

1.3 孕婦羊水細(xì)胞染色體核型分析 取無菌操作采集的羊水細(xì)胞，5 000 r/min離心8 min，棄上清，將沉淀接種至裝有5 mL羊水細(xì)胞培養(yǎng)基（廣州和能生物，LOT：AF20191101）的培養(yǎng)瓶，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～8 d，待發(fā)亮細(xì)胞生長至5～6個(gè)克隆時(shí)，換液再培養(yǎng)24 h，加入秋水仙素0.25μg/mL，處理45 min，收集培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)低滲、固定、滴片、G帶染色，獲取羊水細(xì)胞染色體核型。每份標(biāo)本制備A、B兩線染色體利用染色體分析系統(tǒng)進(jìn)行中期細(xì)胞核型分析。兩名臨床醫(yī)師分A、B雙線分析同一標(biāo)本，每線計(jì)數(shù)15個(gè)核型，分析3個(gè)形態(tài)好的染色體核型，嵌合型加倍計(jì)數(shù)，參見ISCN（2016版）進(jìn)行核型分析診斷［13］。

2 結(jié)果

2.1 X染色體STRs相關(guān)點(diǎn)位基因拷貝數(shù) 達(dá)瑞生物非整倍體檢測試劑盒檢測結(jié)果為，X染色體上C4區(qū)SRY的STR位點(diǎn)，沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，說明樣本為女性，C1、C2、C3、C5 X染色體STR位點(diǎn)均為單峰，C6所在Xq13區(qū)STR位點(diǎn)出現(xiàn)1個(gè)不平衡雙峰，說明Z染色體上Xq13區(qū)帶基因可能存在2個(gè)拷貝，其他區(qū)域基因僅有1個(gè)拷貝（圖1）。

圖1 本例孕婦產(chǎn)前羊水細(xì)胞X染色體Xq13區(qū)域C2、C3、C5、C6位點(diǎn)基因拷貝情況

Devyser緊湊型V3試劑盒檢測結(jié)果為，羊水細(xì)胞X染色體上5個(gè)性別染色體STRs位點(diǎn)（XY1、XY2、X1、X3、X9）均為單峰，2個(gè)X染色體與常染色體STRs位點(diǎn)T1、T3位點(diǎn)上峰高之比為1：1和1：2。說明羊水細(xì)胞在X染色體上Xq13區(qū)域上基因有2個(gè)拷貝，在T3所在Xq21.1區(qū)域上，基因僅有1個(gè)拷貝（圖2）。

圖2 本例孕婦產(chǎn)前羊水細(xì)胞X染色體XY1、XY2、X1、X3、X9等位點(diǎn)基因拷貝情況

無錫中德美聯(lián)AGCU 19X-STR多重?zé)晒鈴?fù)合擴(kuò)增試劑盒檢測結(jié)果為，在X染色體上DXS10159、DXS10164、DXS10162、DXS10079、DXS10074等5個(gè)位點(diǎn)上有不平衡雙峰，而其余14個(gè)X-STRs位點(diǎn)均為單峰（圖3）。

圖3 本例孕婦產(chǎn)前羊水細(xì)胞X染色體DXS10159、DXS10164、DXS10162、DXS10079、DXS10074等位點(diǎn)基因拷貝情況

2.2 羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果 共計(jì)數(shù)100個(gè)羊水細(xì)胞染色體核型，其中46，Xn，+mar占33組，45，X占67組。最終羊水細(xì)胞核型分析為：46，Xn，+mar［33］/45，X［67］，為嵌合型核型。羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果見圖4。

圖4 本例孕婦羊水細(xì)胞染色體核型分析結(jié)果

3 討論

QF-PCR法通過對染色體上的標(biāo)記STR遺傳位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，將同源染色體上兩條等位基因的熒光峰高或峰面積的計(jì)算來量化染色體攜帶遺傳物質(zhì)的數(shù)量。每一個(gè)正常的二倍體樣本與之相對應(yīng)的則是體細(xì)胞染色體上的等位基因。根據(jù)國際公認(rèn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)（歐盟ACC/CMGS），Devyser緊湊型V3試劑盒（瑞典）采用在人群中具有高度的異質(zhì)性和多態(tài)性的STR基因座，設(shè)計(jì)了7個(gè)性別染色體STR位點(diǎn)來評估X染色體上遺傳信息的拷貝數(shù)。該試劑盒檢測到本例羊水標(biāo)本的5個(gè)性別染色體STRs為單峰，未能提供X染色體上STR拷貝數(shù)的有效信息，2個(gè)X染色體與常染色體STRs位點(diǎn)T1、T3位點(diǎn)上峰高之比為1∶1和1∶2，提示該羊水細(xì)胞在T1所在Xq13區(qū)域上基因有2個(gè)拷貝，在T3所在Xq21.1區(qū)域上，基因僅有1個(gè)拷貝。在達(dá)瑞生物非整倍體檢測試劑盒檢測結(jié)果中，C4所在SRY的檢測STR位點(diǎn)沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，說明為一女性標(biāo)本，C1、C2、C3、C5 4個(gè)X-STR位點(diǎn)均為單峰，C6所在Xq13的STR位點(diǎn)，有1個(gè)不平衡雙峰出現(xiàn)，提示在Xq13區(qū)帶上的基因可能存在2個(gè)拷貝，其他區(qū)域基因僅有1個(gè)拷貝。為尋找更多X染色體上STRs位點(diǎn)信息，我們利用無錫中德美聯(lián)AGCU 19X-STR多重?zé)晒鈴?fù)合擴(kuò)增試劑盒檢測，結(jié)果在DXS10159、DXS10164、DXS10162、DXS10079、DXS10074等5個(gè)位點(diǎn)上有不平衡雙峰，而其余14個(gè)X-STRs位點(diǎn)均為單峰，我們推測，在此5個(gè)STR所分布的著絲粒和Xq12區(qū)域上，基因有2個(gè)拷貝，而之外的區(qū)域，基因僅有1個(gè)拷貝。進(jìn)一步羊水細(xì)胞培養(yǎng)后染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，該羊水標(biāo)本細(xì)胞核型為46，X，+mar［33］/45，X［67］，為嵌合型核型，因此結(jié)合STRs檢測結(jié)果我們最終推論，該羊水細(xì)胞丟失一條X染色體，此條染色體僅殘留著絲粒至q13區(qū)域，形成46，X，+mar與45，X兩種核型的嵌合，因而大部分X-STRs為單峰，而在著絲粒至Xq13區(qū)域的STRs有雙峰出現(xiàn)。

與傳統(tǒng)核型分析方法比較，QF-PCR法檢測STRs具有周期短、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)［14］。但根據(jù)STR檢測原理，其對染色體數(shù)目異常嵌合體和染色體結(jié)構(gòu)的異常不敏感，常檢測不到異常位點(diǎn)，容易導(dǎo)致漏診，在僅一個(gè)或兩個(gè)位點(diǎn)異常時(shí)，應(yīng)考慮低比例數(shù)目異常嵌合的存在，此時(shí)應(yīng)尋求更多STRs位點(diǎn)的信息綜合評估嵌合體存在的可能。傳統(tǒng)的染色體核型分析是目前診斷染色體病的金標(biāo)準(zhǔn)，對染色體異常具有最直接、準(zhǔn)確的判斷，是指導(dǎo)臨床遺傳咨詢的依據(jù)之一［15-17］，借助傳統(tǒng)的細(xì)胞核型分析，可明確嵌合體的診斷及嵌合比例。

在臨床檢測中，結(jié)合STR位點(diǎn)分析與染色體核型分析，可為嵌合體核型提供更多的遺傳數(shù)據(jù)作為遺傳學(xué)分析的證據(jù)［18-21］。

此案例中45，X核型占67%，X染色體殘留mar核型占33%，QF檢測X染色體區(qū)域出現(xiàn)1個(gè)位點(diǎn)可疑雙峰，此時(shí)染色體微陣列檢測可能出現(xiàn)X染色體信號減弱、或者信號難以判斷的情況，為此可利用其他檢測方法以尋求更多遺傳學(xué)信息。AGCU 19XSTR多重?zé)晒鈴?fù)合擴(kuò)增試劑盒是檢測X染色體上STR位點(diǎn)的檢測系統(tǒng)，可判斷X染色體上基因的拷貝數(shù)。本研究中，45，X為主要羊水細(xì)胞染色體核型，低比例核型有不明來源的片段。QF出現(xiàn)單個(gè)X位點(diǎn)兩個(gè)拷貝的可疑信號，因此，我們選擇AGCU 19X-STR多重?zé)晒鈴?fù)合擴(kuò)增試劑盒對此樣本X染色體STR位點(diǎn)進(jìn)行檢測分析，發(fā)現(xiàn)Xq13區(qū)域的STRs有雙峰信號，說明此區(qū)域基因有兩個(gè)拷貝。綜合分析推斷，一條X染色體殘留片段可能以mar形式存在，因而出現(xiàn)46，X，+mar［33］/45，X［67］的核型表現(xiàn)，而QF、STRs檢測部分區(qū)域基因出現(xiàn)兩個(gè)拷貝的雙峰型，此標(biāo)本的各項(xiàng)遺傳學(xué)檢測結(jié)果可相互解釋映證。

綜上所述，唐篩18三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦產(chǎn)前羊水細(xì)胞X染色體部分缺失，絲粒至q13區(qū)域保存，羊水細(xì)胞染色體核型為46，X，+mar［33］/45，X［67］，胎兒為嵌合體。QF-PCR法檢測STRs聯(lián)合傳統(tǒng)核型分析可對嵌合型染色體數(shù)目異常提供診斷支持，為臨床產(chǎn)前診斷提供支持。