王 明，張家濤，周 斌，丁 潔，徐趙萌，孫 彤,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 201306；3.浙江新銀象生物工程有限公司，浙江 臺州 318000）

水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌的生長繁殖是引起水產(chǎn)品腐敗的主要因素之一，腐敗希瓦氏菌是水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌之一[1]。丁香的主要化學成分為揮發(fā)油類和黃酮等，揮發(fā)油相對含量為14%～20%，其中丁香酚的相對含量為78%～95%。丁香酚具有抗癌、抗氧化、抗衰老和抗菌性能[2-4]。周倩倩[5]和Devi[6-7]等研究發(fā)現(xiàn)，丁香酚對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出很好的抗菌活性。麝香草酚又稱百里（香）酚，化學名為5-甲基-2-異丙基酚，是一種單萜酚，主要存在于百里香屬植物中，也是百里香屬植物揮發(fā)油的主要成分[8]。其具有抗菌、消炎等功效[9-11]，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有很好的抗菌活性[12-13]。逄炳棟[14]的研究表明，麝香草酚分布在細胞膜的多聚糖層，通過抑制主要活性成分的合成及蛋白質(zhì)的形成，從而抑制細菌的生長繁殖。乳酸菌在代謝過程中會生成乳酸等有機酸，降低環(huán)境中的pH值，此過程對乳酸菌自身生長無明顯影響，但可抑制有害菌增殖，未解離的有機酸通過自由擴散進入細菌細胞膜內(nèi)，在菌體內(nèi)解離釋放質(zhì)子，降低了菌體內(nèi)環(huán)境的pH值，破壞了細菌內(nèi)部的酸堿平衡，造成菌體死亡[15]。溶菌酶廣泛存在于動植物和微生物等體內(nèi)，由18 種129 個氨基酸殘基構(gòu)成，分子質(zhì)量約14 000 Da，是一種天然的穩(wěn)定蛋白酶[16]。溶菌酶具有很好的抗菌性能，其對革蘭氏陽性菌的抗菌性能優(yōu)于革蘭氏陰性菌[17-18]。

應用于食品保鮮的復合生物保鮮劑備受關(guān)注，它不僅可以減少單一保鮮劑的使用量，也可拓寬其抑菌譜，發(fā)揮其廣譜抑菌作用。王葉青等[19]研究發(fā)現(xiàn)，菊花精油和金盞花精油復配對枯草芽孢桿菌具有協(xié)同抑菌作用。Zhang Jiatao[20]和Yang Hua[21]等分別發(fā)現(xiàn)茶多酚與溶菌酶復合保鮮劑、茶多酚與ε-聚賴氨酸鹽酸鹽復合保鮮劑對腐敗希瓦氏菌均有協(xié)同抗菌作用。而對丁香酚復合保鮮劑的抗菌性能和抗菌機理的研究鮮有報道。

本研究以水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌——腐敗希瓦氏菌為抗菌對象，選用丁香酚、丁香酚/麝香草酚、丁香酚/乳酸和丁香酚/溶菌酶（食品級和生物級）為保鮮劑，研究其抗菌性能及作用機制。采用抑菌圈法表征丁香酚及其復合保鮮劑對腐敗希瓦氏菌的抗菌性能，通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）和透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察菌體的微觀形態(tài)變化，測定腐敗希瓦氏菌菌體細胞膜的通透性、完整性、損傷程度以及菌體內(nèi)Na＋、K＋-腺苷三磷酸酶（adenosine triphosphatase，ATPase）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKPase）活性變化，分析丁香酚及其保鮮劑的抗菌機制。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

腐敗希瓦氏菌（ATCC 8071） 美國微生物菌種保藏中心。

半乳糖苷酶釋放法和正苯基萘胺攝入法細菌膜損傷熒光檢測試劑盒、細菌可溶性總蛋白質(zhì)制備試劑盒 上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司；超微量Na＋、K＋-ATPase測定試劑盒、AKPase測定試劑盒、考馬斯亮藍試劑盒 南京建成生物工程研究所；L-乳酸（純度為90%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；溶菌酶（食品級，18 U/mg） 上海鼎盛生物科技有限公司；溶菌酶（生物級，20 000 U/mg）上海麥克林生化科技有限公司；LB肉湯、LB營養(yǎng)瓊脂北京奧博星生物試劑有限公司；去離子水（電導率小于20 μS/cm）為實驗室自制；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MLS-3030CH型立式高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋有限公司；LQ-C5001型電子天平 上?，幮码娮涌萍加邢薰荆籐RH-150型生化培養(yǎng)箱、DK-8D型恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司；THZ-D型臺式恒溫振蕩箱太倉市實驗設備廠；X1R型高速冷凍離心機、Legend Micro21R型臺式微量離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Victor X3型酶標儀 上海珀金埃爾默儀器有限公司；S-4800型場發(fā)射SEM 日本日立公司；Jem-2100F型場發(fā)射TEM 日本電子公司；FE38-Meter型電導率儀 瑞士梅特勒-托利多公司；UV-2550型紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Scientz-IID型超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ZD-9556型脫色搖床 常州市凱航儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丁香酚復合保鮮劑抗菌性能測定

以體積分數(shù)30%乙醇溶液為溶劑，分別配制0.3%（質(zhì)量分數(shù)，下同）丁香酚、0.1%麝香草酚、1.0%乳酸、2.4%溶菌酶（食品級）、2.4%溶菌酶（生物級）和0.15%＋0.05%丁香酚/麝香草酚、0.15%＋0.50%丁香酚/乳酸、0.15%＋1.20%丁香酚/溶菌酶（食品級）和0.15%＋1.20%丁香酚/溶菌酶（生物級）的保鮮劑溶液，并以30%乙醇溶液為對照組。參照王夢如等[22]的方法并作適當修改，采用牛津杯法，分別加入200 μL上述一定質(zhì)量分數(shù)的抗菌劑，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測定各保鮮劑作用后腐敗希瓦氏菌的抑菌圈直徑。

1.3.2 腐敗希瓦氏菌微觀形態(tài)觀察

取適量新鮮菌懸液于50 mL離心管中，于3 000 r/min離心10 min，棄上清液，用磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 7.4）稀釋并調(diào)節(jié)菌懸液濃度至OD600nm≈0.5。取10 mL菌懸液，加入保鮮劑至所需添加水平，于28 ℃振蕩培養(yǎng)。12 h后取出部分菌懸液，參照楊麗麗[23]的方法對腐敗希瓦氏菌樣品進行后續(xù)處理，采用離子濺射儀于20 kV下噴金3 min，再采用場發(fā)射SEM觀察保鮮劑處理前后菌體的微觀形態(tài)。經(jīng)染色、切片處理后，采用場發(fā)射TEM觀察保鮮劑處理前后菌體內(nèi)部的微觀形態(tài)。

1.3.3 腐敗希瓦氏菌細胞膜通透性、完整性和損傷程度測定

細胞膜通透性測定：菌體培養(yǎng)和抗菌過程參考1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)。之后每間隔一段時間測定菌懸液的電導率，至電導率不再變化為止。

細胞膜完整性測定：參考李元政等[24]方法，每20 min取0.5 mL的菌懸液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，采用酶標儀測定濾液在260 nm波長處的吸光度，至吸光度不再變化為止。

細胞膜損傷程度測定：參照正苯基萘胺攝入法細胞膜損傷熒光檢測試劑盒說明書，采用Victor X3型酶標儀測定細胞膜外膜損傷程度；參照半乳糖苷酶釋放法細胞膜損傷熒光檢測試劑盒說明書，采用Victor X3型酶標儀測定細胞膜內(nèi)膜損傷程度。

1.3.4 腐敗希瓦氏菌Na＋、K＋-ATPase、AKPase活力測定

在菌體培養(yǎng)、抗菌12 h后，參照超微量Na＋、K＋-ATPase活力測定試劑盒說明書進行菌體樣品處理、酶促反應及定磷實驗并測定Na＋、K＋-ATPase活力；參照AKPase活力測定試劑盒說明書測定AKPase活力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每個實驗做3 次平行，結(jié)果均以平均值±標準偏差表示。采用Origin 9.0軟件作圖。采用SPSS 19.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)，并采用Duncan檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香酚復合保鮮劑抗菌性能分析結(jié)果

丁香酚復合保鮮劑對水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌——腐敗希瓦氏菌的抗菌性能如表1所示。丁香酚、麝香草酚、乳酸、食品級的溶菌酶作用于腐敗希瓦氏菌后，均表現(xiàn)出較好的抑菌性能，而生物級別的溶菌酶無抑菌性能。與單一保鮮劑相比，丁香酚復合保鮮劑的抑菌性能更優(yōu)。說明丁香酚與其他保鮮劑復配后，對腐敗希瓦氏菌有協(xié)同抗菌作用。

表1 丁香酚復合保鮮劑的抑菌圈直徑Table 1 Inhibitory zone diameters of eugenol-containing composite preservatives

2.2 丁香酚復合保鮮劑對腐敗希瓦氏菌微觀形態(tài)的影響

經(jīng)丁香酚復合保鮮劑處理前后的腐敗希瓦氏菌微觀形貌如圖1所示。對照組的腐敗希瓦氏菌呈桿狀，表面光滑且個體飽滿，無形變損傷，菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整，細胞壁邊緣較清晰，細胞膜包裹著細胞質(zhì)，細胞質(zhì)比較均勻地分布在細胞內(nèi)（圖1A1、A2）。由圖1B1、B2可見，經(jīng)丁香酚處理后，腐敗希瓦氏菌稍有扭曲變形，菌體中間部位的細胞壁膜破損裂開、有明顯凹陷。菌體內(nèi)部的細胞壁膜變薄甚至消失，細胞質(zhì)流失較多，菌體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。分析認為，丁香酚可與細胞膜的磷脂反應，增加細胞膜通透性，使細胞出現(xiàn)孔洞甚至破裂，導致細胞內(nèi)容物滲漏，使細胞死亡，這與Devi等[7]的研究結(jié)果一致。由圖1C1、C2可見，經(jīng)丁香酚/麝香草酚處理后，腐敗希瓦氏菌出現(xiàn)了質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細胞壁膜溶解，細胞質(zhì)內(nèi)容物分布不均，且有部分流失。分析認為，可能是麝香草酚中共同存在疏水性很強的苯環(huán)和親水性較強的酚羥基，使其能夠很快融入細菌的細胞膜中，因此，丁香酚與麝香草酚復配后可增加細胞膜通透性，使膜電位降低，細菌細胞膜上的離子通道被打開或被溶解損壞，細胞破裂，菌體內(nèi)容物發(fā)生泄露[12-13,25]。由圖1D1、D2可見，經(jīng)丁香酚/乳酸處理的腐敗希瓦氏菌菌體出現(xiàn)褶皺、部分凹陷，細胞壁不完整，有溶解消失現(xiàn)象，造成細胞質(zhì)內(nèi)容物分布不均勻，飽滿感缺失。丁香酚對腐敗希瓦氏菌細胞膜能產(chǎn)生一定損傷，與乳酸復配后，未解離的乳酸更多地通過自由擴散進入細菌細胞膜內(nèi)，在菌體內(nèi)解離并釋放質(zhì)子，破壞細菌內(nèi)部的酸堿平衡，進一步干擾細胞膜的正常代謝，從而對細菌的破壞進一步加強[15]。

由圖1E1、E2可見，經(jīng)丁香酚/溶菌酶（食品級）處理后，腐敗希瓦氏菌菌體細胞嚴重變形，褶皺加深，細胞部分萎縮，細胞壁膜損傷程度較重，造成內(nèi)容物流出，密度下降，這是丁香酚與溶菌酶協(xié)同抗菌作用的結(jié)果。丁香酚首先與腐敗希瓦氏菌細胞壁脂多糖層作用，使細胞壁肽聚糖層暴露，進而導致溶菌酶將暴露于表面的肽聚糖中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4-糖苷鍵水解，引起細胞裂解死亡[26]。由圖1F1、F2可見，經(jīng)丁香酚/溶菌酶（生物級）處理后，腐敗希瓦氏菌的菌體結(jié)構(gòu)完全遭到破壞，細胞壁膜溶解嚴重，壁膜消失，細胞內(nèi)容物嚴重流失，胞內(nèi)物質(zhì)向細胞膜一側(cè)集中，并出現(xiàn)空腔。這可能是由于生物級溶菌酶比食品級溶菌酶純度更高，活力更強。

圖1 丁香酚復合保鮮劑處理前后腐敗希瓦氏菌的SEM和TEM圖Fig. 1 SEM and TEM images of S. putrefaciens before and after treatment with eugenol-containing composite preservative

2.3 丁香酚復合保鮮劑對腐敗希瓦氏菌細胞膜通透性及完整性的影響

細胞膜是細菌的保護屏障，保鮮劑破壞細菌的細胞膜后，會引起內(nèi)部電解質(zhì)如K＋、Ca2＋、Na＋等小分子離子外泄至培養(yǎng)液，導致其電導率上升，因此，菌懸液電導率的變化可以反映細菌細胞膜通透性變化[20]。由圖2A可知，隨著保鮮劑對腐敗希瓦氏菌處理時間的延長，菌懸液的電導率逐漸上升直至趨于平穩(wěn)。經(jīng)丁香酚復合保鮮劑處理后，菌懸液的電導率明顯高于同期未處理樣品。說明丁香酚提高了菌體細胞膜的通透性，導致菌體細胞內(nèi)電解質(zhì)泄漏。與單一丁香酚相比，經(jīng)丁香酚/麝香草酚復合保鮮劑處理的腐敗希瓦氏菌菌懸液的電導率略高，說明丁香酚與麝香草酚復配后，對腐敗希瓦氏菌細胞膜流動性的破壞能力略有增強，加速了胞內(nèi)電解質(zhì)的流失，兩者具有協(xié)同抗菌作用；而經(jīng)丁香酚/乳酸復合保鮮劑處理后，腐敗希瓦氏菌菌懸液電導率與單一丁香酚處理樣品無明顯差異。這是由于丁香酚與乳酸復配并作用于菌體后，丁香酚首先破壞細菌外膜的磷脂、糖脂成分，打開離子通道，隨后未解離乳酸通過自由擴散由細胞外膜進入菌體內(nèi)，釋放質(zhì)子，干擾細菌正常代謝，而對細菌細胞膜組分無直接的破壞作用。經(jīng)丁香酚/溶菌酶復合保鮮劑處理后，腐敗希瓦氏菌菌懸液的電導率高于單一丁香酚和丁香酚/麝香草酚處理的樣品。這是由于丁香酚與腐敗希瓦氏菌細胞壁脂多糖層作用后，使細胞壁肽聚糖層暴露，而后溶菌酶水解暴露于表面的肽聚糖中的β-1,4-糖苷鍵，因兩者具有協(xié)同增效作用，加速了細胞內(nèi)電解質(zhì)的流失[17]。在處理初期，經(jīng)丁香酚/溶菌酶（食品級）處理后的腐敗希瓦氏菌菌液電導率明顯高于丁香酚/溶菌酶（生物級）處理樣品，這可能是因為食品級溶菌酶中含有部分其他抗菌劑，發(fā)揮了較好的抗菌性能。在處理后期，丁香酚/溶菌酶（生物級）處理的菌懸液電導率最高，這可能是因為丁香酚作用后，使腐敗希瓦氏菌細胞壁的肽聚糖層充分暴露，溶菌酶的作用就更加出色。同時，生物級溶菌酶的純度和酶活性較高，對菌體細胞壁的破壞能力更強。

圖2 丁香酚復合保鮮劑對腐敗希瓦氏菌細胞膜通透性（A）及完整性（B）的影響Fig. 2 Effect of eugenol-containing composite preservatives on cell membrane permeability (A) and cell membrane integrity (B) of S. putrefaciens

通常情況下，細菌細胞膜控制細胞內(nèi)外物質(zhì)自由進出，細菌細胞壁膜的微孔道只能透過粒徑小于1 nm的分子，而蛋白質(zhì)和核酸等大分子無法透過細胞壁和細胞膜，在細胞膜遭受損傷后，細胞內(nèi)的物質(zhì)極易發(fā)生外滲，包括K＋、PO43－等小分子物質(zhì)和DNA、RNA等大分子物質(zhì)，由于DNA和RNA在260 nm波長處具有很高的摩爾吸光系數(shù)，因此被稱為260 nm吸收物質(zhì)，可通過測定260 nm吸收物質(zhì)吸光度確定細菌細胞膜的完整性[27]。由圖2B可見，隨著保鮮劑作用時間的延長，腐敗希瓦氏菌菌懸液的吸光度逐漸上升。對照組菌懸液的吸光度上升較慢；經(jīng)丁香酚處理初期，菌懸液的吸光度上升速率增加緩慢，而在200 min后，其上升速率加快，明顯高于未處理的腐敗希瓦氏菌，說明丁香酚對細菌細胞膜具有一定的破壞能力，但作用于菌體后不能立刻使細胞膜破壞，而作用一定時間后才能破壞菌體細胞膜，使細胞內(nèi)DNA、RNA等大分子物質(zhì)流出。采用丁香酚復合保鮮劑處理后，菌懸液的吸光度上升加快，其中丁香酚/溶菌酶（食品級）處理的菌懸液吸光度上升最快，丁香酚/溶菌酶（生物級）和丁香酚/麝香草酚次之，丁香酚/乳酸較慢，但高于單一丁香酚處理的樣品，說明麝香草酚、溶菌酶和乳酸與丁香酚復配后對腐敗希瓦氏菌細胞膜的破壞能力增強，具有協(xié)同破壞能力。經(jīng)分析認為乳酸以未解離的有機酸分子形式通過自由擴散進入細菌，在細菌體內(nèi)解離并釋放出質(zhì)子，降低了細菌內(nèi)的pH值，破壞了細菌內(nèi)部的酸堿平衡，造成菌體死亡[15]。同時，乳酸解離后，引起細胞內(nèi)酸性離子增多，增大細菌細胞內(nèi)的滲透壓，導致細菌破裂死亡[28]，此外，乳酸解離會使細胞內(nèi)某些酶鈍化或變性，影響細菌體內(nèi)大分子物質(zhì)的合成，進而使細菌的生長、繁殖和代謝受到抑制，甚至死亡[29]，故丁香酚與乳酸復配后可加速菌體內(nèi)DNA、RNA等大分子物質(zhì)流出。同時，乳酸是在丁香酚破壞細胞外膜后才大量進入細胞內(nèi)部的，所需的作用時間較長，故其菌懸液的吸光度上升較慢。由于丁香酚和麝香草酚復配后可使膜電位差降低，增加細胞膜通透性，打破了菌體原有的保護屏障，從而導致胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏增加[7,12-13]。因此，采用丁香酚/麝香草酚處理后，腐敗希瓦氏菌菌懸液的吸光度高于同期丁香酚處理的樣品。而溶菌酶可水解經(jīng)丁香酚作用后暴露于細菌表面的細胞壁肽聚糖中的β-1,4-糖苷鍵，增加了對細菌細胞膜的破壞程度，從而導致胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏增加。因此，采用丁香酚/溶菌酶處理后，菌懸液的吸光度較高。又由于食品級溶菌酶中含有其他抑菌劑，對腐敗希瓦氏菌膜的損傷能力更大，因此采用丁香酚/溶菌酶（食品級）處理后，菌懸液的吸光度最高。

2.4 丁香酚復合保鮮劑對腐敗希瓦氏菌細胞膜損傷程度的影響

當細胞膜遭到損害時，正苯基萘胺能夠進入外膜磷脂層，可通過其產(chǎn)生的藍色熒光評價細菌外膜的損傷程度。由圖3A可見，經(jīng)丁香酚處理后，腐敗希瓦氏菌的外膜通透性增加。經(jīng)丁香酚/麝香草酚和丁香酚/乳酸處理后，菌體的外膜通透性進一步增加，經(jīng)丁香酚/溶菌酶（食品級）處理后，菌體的外膜通透性低于單一丁香酚處理的樣品。而經(jīng)丁香酚/溶菌酶（生物級）處理后，菌體的外膜通透性增加最顯著。分析認為，麝香草酚、乳酸與丁香酚一樣具有對細胞膜外膜的破壞能力，且與丁香酚復合后其破壞能力增強。此外，生物級溶菌酶在丁香酚作用后，對細胞膜外膜的破壞能力更強，兩者具有協(xié)同增效作用。

圖3 丁香酚復合保鮮劑對腐敗希瓦氏菌細胞外膜（A）、內(nèi)膜（B）通透性的影響Fig. 3 Effect of eugenol-containing composite preservatives on extracellular membrane (A) and intracellular membrane (B) integrity of S. putrefaciens

菌懸液中β-半乳糖苷酶的熒光強度與細菌內(nèi)膜的破損程度呈正相關(guān)。由圖3B可見，經(jīng)丁香酚處理后，腐敗希瓦氏菌的內(nèi)膜被破壞。與丁香酚相比，丁香酚與麝香草酚或溶菌酶復配后，腐敗希瓦氏菌的內(nèi)膜損傷更嚴重，且丁香酚/麝香草酚對菌體細胞內(nèi)膜的損傷程度最大。這是由于在麝香草酚的疏水性和親水性基團共同作用下，對菌體細胞膜的內(nèi)膜破壞能力更強，且二者發(fā)揮了協(xié)同增效作用。而丁香酚和溶菌酶在協(xié)同破壞細胞外膜之后，兩者也會共同作用于細胞內(nèi)膜，促進了菌體內(nèi)膜的破壞。用丁香酚/乳酸處理后，對腐敗希瓦氏菌內(nèi)膜的破壞沒有顯著差異，這可能是由于丁香酚含量較少，且乳酸對細胞內(nèi)膜無破壞能力。

2.5 丁香酚復合保鮮劑對腐敗希瓦氏菌體內(nèi)Na＋、K＋-ATPase和AKPase活力的影響

由圖4A可見，經(jīng)丁香酚處理后，腐敗希瓦氏菌的Na＋、K＋-ATPase活力顯著降低，說明丁香酚能夠降低菌體的Na＋、K＋-ATPase活力。與丁香酚相比，經(jīng)丁香酚/麝香草酚和丁香酚/溶菌酶（食品級）處理后，腐敗希瓦氏菌的Na＋、K＋-ATPase活力顯著提高，這可能是由于麝香草酚和食品級溶菌酶中的活性抗菌成分主要作用于細菌壁膜，而對菌體Na＋、K＋-ATPase的活性影響較小。經(jīng)丁香酚/乳酸和丁香酚/溶菌酶（生物級）處理的腐敗希瓦氏菌的Na＋、K＋-ATPase活力遠低于單一丁香酚處理的樣品，說明乳酸進入細胞后可作用于Na＋、K＋-ATPase，使其活性降低。而生物級溶菌酶在丁香酚破壞細胞外膜脂多糖層后，與其協(xié)同破壞細胞膜其他組分，使菌體被嚴重破壞，菌體內(nèi)的Na＋、K＋-ATPase失去正常發(fā)揮作用的環(huán)境，表現(xiàn)出Na＋、K＋-ATPase活力總體降低。

圖4 經(jīng)丁香酚復合保鮮劑處理對腐敗希瓦氏菌Na＋、K＋-ATPase（A）、AKPase（B）活力的影響Fig. 4 Effect of eugenol-containing composite preservatives on Na+,K+-ATPase (A) and AKPase (B) activities of S. putrefaciens

由圖4B可見，經(jīng)丁香酚處理的腐敗希瓦氏菌AKPase活力顯著降低，說明丁香酚能顯著抑制菌體AKPase活性，這與儀淑敏[30]的研究結(jié)果相似。分析認為，丁香酚在破壞菌體細胞壁膜后進入內(nèi)環(huán)境，作用于AKPase，降低了AKPase活性，從而抑制了菌體的生長和代謝。與丁香酚相比，丁香酚復合保鮮劑對AKPase活性的抑制能力更強，說明麝香草酚、乳酸和溶菌酶菌與丁香酚存在協(xié)同效應，使其對AKPase活性的抑制能力增強。

3 結(jié) 論

丁香酚分別與麝香草酚、乳酸和溶菌酶復配后，對腐敗希瓦氏菌均具有協(xié)同抗菌作用，使菌體結(jié)構(gòu)損傷加劇。丁香酚及其復合保鮮劑對菌體的作用機制略有不同。丁香酚與溶菌酶（生物級）復配后，對細胞質(zhì)膜的破壞能力最大。丁香酚與乳酸復配后，對Na＋、K＋-ATPase活力的抑制更加顯著。丁香酚與不同級別溶菌酶復配后，可嚴重破壞細胞膜完整性，顯著增加細胞膜通透性。而由于兩種級別溶菌酶的純度和酶活性存在差異，丁香酚/溶菌酶（生物級）復合保鮮劑可顯著增加細菌內(nèi)、外膜的通透性，且對Na＋、K＋-ATPase、AKPase活性的抑制作用最強，而丁香酚/溶菌酶（食品級）復合保鮮劑主要增加細胞內(nèi)膜通透性，而對細胞外膜通透性的影響較弱。本實驗研究了丁香酚復合保鮮劑對水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌——腐敗希瓦氏菌的抗菌性能，并闡明了其抗菌機理，可為提高丁香酚復合保鮮劑的性能并減少其使用量、降低生產(chǎn)成本提供參考。本研究結(jié)果可廣泛應用于水產(chǎn)品保鮮方面，具有廣闊的市場前景。