柏 雪，陳 宇，趙立軍，張 靜

（1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川 成都 610041；2.農業(yè)農村部畜禽產品質量安全風險評估實驗室（成都），四川 成都 610041）

氟苯尼考又稱氟甲砜霉素，是氯霉素類廣譜抗菌藥的一種，廣泛應用于豬、雞、魚的疾病治療，主要經由腎臟排出，少量經糞便排出[1]。氟苯尼考胺是氟苯尼考的代謝產物之一，其在動物肝臟中的存留時間相較于氟苯尼考的其他代謝產物更長，常作為動物源食品中氟苯尼考的標示性殘留物[2]。氟苯尼考與氯霉素和甲砜霉素相比較，毒性較低、環(huán)境污染較小，但長期食用殘留有氟苯尼考的食物會導致微生物耐藥性的產生，同時對免疫有一定的抑制作用，也會對胚胎造成負面影響[3-7]。Hu Dongfang[6]和El-Ela[7]等發(fā)現氟苯尼考會引起小鼠脾和胸腺發(fā)育不全和萎縮，誘導脾細胞凋亡，降低淋巴細胞的增殖和存活能力，抑制體液免疫和細胞免疫。氟苯尼考對動物機體的抗氧化系統(tǒng)也有明顯的破壞作用，可以抑制微粒體酶的表達或直接誘導微粒體酶發(fā)生氧化。Ren Xianyun等[8]發(fā)現氟苯尼考顯著抑制了肝胰腺抗氧化系統(tǒng)的功能，氟苯尼考誘導I期和II期解毒基因的轉錄表達，并改變其相應酶（紅霉素N-脫甲基酶和谷胱甘肽S-轉移酶）的表達。氟苯尼考還可抑制線粒體蛋白質合成，使線粒體形態(tài)受損，通過AMP活化蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/p70S6K（AMPK/mTOR/p70S6K）途徑抑制p70S6K的磷酸化，從而抑制細胞生長和增殖[9]。

為保障食品安全，各國對氟苯尼考殘留限量有明確的規(guī)定。GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定，氟苯尼考最高殘留限量為氟苯尼考與氟苯尼考胺之和，家禽肌肉、皮膚＋脂肪、肝臟和腎臟中殘留限量分別為100、200、2 500 μg/kg和750 μg/kg[10]，與歐盟和美國的限量相當[11]，但并未對雞蛋中殘留限量進行規(guī)定，僅規(guī)定家禽產蛋期禁用氟苯尼考[10]。近幾年相關部門對市場抽樣檢測發(fā)現雞蛋中氟苯尼考殘留問題層出不窮，國家市場監(jiān)管總局通報的雞蛋氟苯尼考殘留事件就有2017年上海、廣東、山西、陜西、海南等地的15 批次；2018年上海、天津、山東等地的62 批次；2019年廣東、廣西等地的12 批次；2020年2月福建的2 批次等。雞蛋中的氟苯尼考可能來源于以下幾個方面：1）飼養(yǎng)期間藥物超劑量使用；2）生產中對產蛋期定義理解有歧義；3）休藥期制定不合理。禽類在產蛋開始前，卵巢中就已有很多卵母細胞，卵母細胞通過自身分泌合成營養(yǎng)物質和吸收外源細胞（如肝臟細胞）供給的物質（如卵黃前體）逐步形成小卵黃，按照相關規(guī)定，該階段可以對雞使用氟苯尼考，此時卵黃中必然會有藥物殘留。經過8～14 d，卵黃逐步發(fā)育成熟，最大的卵黃脫離卵巢到達輸卵管，膨大部被蛋清包裹，再于輸卵管后部經18～20 h形成蛋殼產出體外[12]，卵黃的名稱則變?yōu)榈包S，此時產蛋期開啟。一般認為生產中商品蛋雞群體產蛋率達到5%為正式開產。因此研究氟苯尼考在家禽體內的清除規(guī)律，確定氟苯尼考的休藥期對保障動物性食品質量安全有重要意義。但目前關于氟苯尼考殘留清除規(guī)律的研究主要集中在水產方面[13-14]，雞蛋和雞肉中的研究報道較少，卵黃中氟苯尼考及氟苯尼考胺的清除規(guī)律研究鮮見報道。綜合上述因素，本實驗以蛋雞為模型，通過投喂蛋雞不同劑量的氟苯尼考，研究其對蛋雞生產性能及健康的影響，確定其在雞蛋、卵黃、肌肉、肝臟中的清除規(guī)律，建立殘留數學模型，為氟苯尼考相關標準的制定及風險評估提供科學依據，為畜產品安全保障提供數據支持，以確保食品質量安全。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

所選用的羅曼粉殼蛋雞為350 日齡、體質量（1.97±0.07）kg，處于產蛋高峰期。

氟苯尼考（純度98.8%） 杭州愛力邁動物藥業(yè)有限公司提供；氟苯尼考、氟苯尼考胺、D5-氯霉素（均為標準品） 德國Sigma公司；乙腈（色譜純）、正己烷（色譜純） 德國Merck公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

1290/6460液相色譜-質譜/質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 雞的飼養(yǎng)管理

實驗在鐵騎力士集團花荄試驗基地進行。將處于產蛋高峰期的羅曼粉殼蛋雞250 只分為5 個處理組，每組5 個重復，每個重復10 只雞。實驗雞均單籠飼養(yǎng)，每個處理組均勻分布在上下兩層，每天喂食2 次（7∶00、15∶00），自由飲水，給藥期為5 d，給藥時間為上午6∶00～7∶00，各處理組給藥劑量分別為0、30、60、120、240 mg/（kgmb·d）。收蛋時間為16∶00～17∶00；休藥期為28 d。保持動物房潔凈，溫度（20±2）℃、相對濕度（55±5）%，光照：14 h光照/10 h黑暗，定期清理糞便，定期消毒。自給藥日起至休藥期結束，每日記錄各個重復組蛋雞產蛋數和每個雞蛋的平均質量（蛋質量），并按式（1）計算不同周期的日均產蛋率。

1.3.2 雞蛋及組織樣品中氟苯尼考、氟苯尼考胺清除規(guī)律分析

1.3.2.1 取樣

休藥第1～28天，每天在各處理組各重復組均隨機挑選2 個雞蛋，人工分離蛋清、蛋黃后，將相同重復組的蛋清和蛋黃分別混合制成混樣，即每個處理組具有5 個重復混樣，于－20 ℃保存待測。

在休藥第1、3、5、7、10、14、21、28天在各處理組的每個重復組分別隨機屠宰1 只雞，即每個處理組5 只雞，采集卵黃、左側胸肌、肝臟，于－20 ℃保存待測。

1.3.2.2 氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留含量的測定

標準液配制：準確稱取適量的氟苯尼考和氟苯尼考胺標準物質，用甲醇配成100 μg/mL的標準儲備溶液，4 ℃保存。準確吸取100 μL D5-氯霉素標準溶液（100 μg/mL）于10 mL容量瓶中，用甲醇配成1 μg/mL的內標標準儲備液。

樣品前處理：稱取5 g樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入內標儲備液（D5-氯霉素）100 μL、25 mL乙酸乙酯、0.75 mL氨水、3 g無水硫酸鈉，勻漿提取30 s，8 000 r/min離心5 min，上清液轉移至50 mL聚丙烯離心管；另取一支50 mL聚丙烯離心管，用20 mL上述上清液洗滌勻漿機刀頭10 s，洗滌液移入第一支離心管中與第一次上清液合并，漩渦振蕩1 min，超聲波振蕩提取5 min，8 000 r/min離心5 min，取上清液，乙酸乙酯定容至50 mL得到提取液。搖勻，移取10 mL提取液于離心管中45 ℃恒溫氮吹至干，離心管中殘渣用2 mL超純水溶解，漩渦振蕩，超聲5 min，加入5 mL正己烷，漩渦振蕩30 s，靜置分層，棄掉上層正己烷，再加入5 mL正己烷，漩渦振蕩30 s，8000 r/min離心10 min，經0.22 μm濾膜過濾后，待測[12]。

色譜條件：色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相：乙腈＋體積分數0.1%甲酸溶液；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。

質譜條件：離子源：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）；氟苯尼考負離子掃描，氟苯尼考胺正離子掃描；檢測方式：多反應選擇離子檢測（multiple reaction monitoring，MRM）；霧化氣、氣簾氣、輔助加熱氣、碰撞氣：高純氮氣；霧化氣溫度：300 ℃。氟苯尼考定性定量離子對：356.0/336.0、356.0/185.0；氟苯尼考胺定性定量離子對：248.3/230/2、248.3/130/2；D5-氯霉素定量離子對：326.1/157.1。

采用內標法定量計算樣品中氟苯尼考的殘留含量，外標法定量計算樣品中氟苯尼考胺的殘留含量。

1.4 數據處理與分析

用SPSS 18.0軟件對藥物殘留數據進行兩因素重復測量數據方差分析，并以休藥時間/d為自變量X1、給藥劑量/（mg/（kgmb·d））為自變量X2，殘留含量為因變量Y（Y1為氟苯尼考含量，Y2為氟苯尼考胺含量，單位均為μg/kg），對其進行回歸分析，建立數學模型；P＜0.05為差異顯著，結果用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 投喂不同劑量氟苯尼考對產蛋雞生產性能的影響

由表1、2可知，休藥1～3 d，240 mg/（kgmb·d）劑量組蛋雞產蛋率顯著低于其他劑量組（P＜0.05），其余各處理組蛋雞產蛋率和平均蛋質量差異均不顯著（P＞0.05）。隨著休藥時間延長，高劑量組的產蛋率也逐步恢復到對照組水平（P＞0.05）。

表1 氟苯尼考給藥期和休藥期蛋雞的產蛋率Table 1 Egg laying rates of laying hens during and after administration with florfenicol%

表2 氟苯尼考給藥期和休藥期蛋雞產蛋的平均質量Table 2 Average mass of eggs from laying hens during and after administration with florfenicol g

2.2 氟苯尼考及氟苯尼考胺在雞蛋中的清除規(guī)律及預測模型建立

2.2.1 休藥期間蛋清中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留含量

由表3可知，各劑量組蛋清中的氟苯尼考含量均在休藥第1天達到峰值，給藥劑量為60 mg/（kgmb·d）時，休藥第8天蛋清中未檢出氟苯尼考；給藥劑量為30、120、240 mg/（kgmb·d）時，休藥第8天均只有1 個樣品檢出氟苯尼考，含量分別為0.74、1.19、3.55 μg/kg，休藥第9天所有劑量組均未檢出。由表4可知，氟苯尼考胺的殘留清除規(guī)律與氟苯尼考類似，未檢出所需休藥時間比氟苯尼考少1 d。

表3 休藥期間蛋清中的氟苯尼考殘留含量（n＝5）Table 3 Residual amounts of florfenicol in egg white at different times after administration (n= 5)μg/kg

表4 休藥期間蛋清中的氟苯尼考胺殘留含量（n＝5）Table 4 Residual amounts of florfenicol amine in egg white at different times after administration (n= 5)μg/kg

氟苯尼考的劑量和休藥時間對蛋清中氟苯尼考及氟苯尼考胺含量的影響高度顯著（P＜0.001），且劑量與休藥時間存在高度顯著的互作效應（P＜0.001），氟苯尼考（P＜0.001，R2＝0.590）、氟苯尼考胺（P＜0.001，R2＝0.672）殘留含量回歸擬合方程分別如公式（2）、（3）所示。

2.2.2 休藥期間蛋黃中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留含量

由表5可知，給藥劑量為30、60 mg/（kgmb·d）時，休藥第12天蛋黃中未檢出氟苯尼考；給藥劑量為120、240 mg/（kgmb·d）時，氟苯尼考含量分別于休藥第2、3天達到峰值，休藥第14天未檢出。由表6可知，30、60、120、240 mg/（kgmb·d）劑量組氟苯尼考胺含量均在休藥第2天達到峰值，分別為（1 126.02±113.10）、（3 180.88±532.25）、（8 530.48±2 346.55）、（25 789.22±1 679.94）μg/kg，所有組藥物未檢出所需休藥時間比氟苯尼考多1 d。

表5 休藥期間蛋黃中的氟苯尼考殘留含量（n＝5）Table 5 Residual amounts of florfenicol in egg yolk at different times after administration (n= 5)μg/kg

表6 休藥期間蛋黃中的氟苯尼考胺殘留含量（n＝5）Table 6 Residual amounts of florfenicol amine in egg yolk at different times after administration (n= 5)μg/kg

投喂氟苯尼考的給藥劑量和休藥時間對蛋黃中氟苯尼考及氟苯尼考胺含量影響均高度顯著（P＜0.001），且給藥劑量與休藥時間互作效應高度顯著（P＜0.001），氟苯尼考（P＜0.001，R2＝0.846）、氟苯尼考胺（P＜0.001，R2＝0.838）殘留含量回歸擬合方程分別如公式（4）、（5）所示。

2.2.3 休藥期間卵黃中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留含量

由表7可知，給藥劑量為30 mg/（kgmb·d）時，休藥第14天卵黃中未檢出氟苯尼考；給藥劑量為60、120、240 mg/（kgmb·d）時，則需休藥21 d才不能在卵黃中檢測出氟苯尼考。由表8可知，給藥劑量為30、60 mg/（kgmb·d）時，休藥第14天卵黃中未檢出氟苯尼考胺；給藥劑量為120、240 mg/（kgmb·d）組，則需休藥21 d才不能在卵黃中檢測出氟苯尼考胺。卵黃消除氟苯尼考和氟苯尼考胺所需的的休藥時間均長于蛋黃。

表7 休藥期間卵黃中的氟苯尼考殘留含量（n＝5）Table 7 Residual amounts of florfenicol in yolk at different times after administration (n= 5)μg/kg

表8 休藥期間卵黃中的氟苯尼考胺殘留含量（n＝5）Table 8 Residual amounts of florfenicol amine in yolk at different times after administration (n= 5)μg/kg

與蛋清、蛋黃相同，給藥劑量和休藥時間對卵黃殘留含量的影響高度顯著（P＜0.001），且互作效應高度顯著（P＜0.001），氟苯尼考（P＜0.001，R2＝0.630）、氟苯尼考胺（P＜0.001，R2＝0.578）殘留含量回歸擬合方程分別如公式（6）、（7）所示。

2.3 氟苯尼考及氟苯尼考胺在肌肉中的清除規(guī)律及預測模型建立

由表9可知，給藥劑量為30、60、120 mg/（kgmb·d）時，休藥第14天時肌肉中未檢出氟苯尼考；給藥劑量為240 mg/（kgmb·d）時，休藥第21天肌肉中未檢出氟苯尼考；各劑量組（30、60、120、240 mg/（kgmb·d））肌肉氟苯尼考含量在休藥第1天達到峰值，分別為（6.91±2.73）、（24.67±11.56）、（45.31±12.27）μg/kg和（115.94±48.14）μg/kg。由表10可知，給藥劑量為30、60 mg/（kg·d）時，休藥第7天均只有1 份樣品檢出氟苯尼考胺，其含量分別為0.71、0.37 μg/kg，休藥第10天未檢出；給藥劑量為120、240 mg/（kgmb·d）時，休藥第10天肌肉中未檢出氟苯尼考胺。

表9 休藥期間肌肉中的氟苯尼考殘留含量（n＝5）Table 9 Residual amounts of florfenicol in muscle at different times after administration (n = 5)μg/kg

表10 休藥期間肌肉中的氟苯尼考胺殘留含量（n＝5）Table 10 Residual amounts of florfenicol amine in muscle at different times after administration (n= 5)μg/kg

肌肉中氟苯尼考（P＜0.001，R2＝0.130）、氟苯尼考胺（P＜0.001，R2＝0.440）殘留含量回歸擬合方程分別如公式（8）、（9）所示。由于方程的決定系數較低，采用給藥劑量與休藥時間推測肌肉中的殘留含量還需進一步研究。

2.4 氟苯尼考及氟苯尼考胺在肝臟中的清除規(guī)律及預測模型建立

由表11可知，給藥劑量為30 mg/（kgmb·d）時，休藥第5天肝臟中未檢出氟苯尼考；給藥劑量為60 mg/（kgmb·d）時，休藥第5天肝臟僅有1 份樣品檢出氟苯尼考，其含量為1.80 μg/kg；給藥劑量為120、240 mg/（kgmb·d）時，休藥第7天肝臟中未檢出氟苯尼考。由表12可知，休藥第7天各劑量組肝臟未檢出氟苯尼考胺。與肌肉相比，肝臟中氟苯尼考和氟苯尼考胺完全消除所需的休藥時間更短。氟苯尼考（P＜0.001，R2＝0.672）、氟苯尼考胺（P＜0.001，R2＝0.664）殘留含量回歸擬合方程分別如公式（10）、（11）所示。

表11 休藥期間肝臟中的氟苯尼考殘留含量（n＝5）Table 11 Residual amounts of florfenicol in liver at different times after administration (n= 5)μg/kg

表12 休藥期間肝臟中的氟苯尼考胺殘留含量（n＝5）Table 12 Residues of florfenicol amine in liver at different times after administration (n= 5)μg/kg

3 討 論

3.1 氟苯尼考對產蛋雞生產性能的影響

氟苯尼考是治療用藥，主要用于豬、雞、魚呼吸道疾病的治療，低劑量下有一定的促生長效果[15]。但高劑量或長期使用氟苯尼考會降低動物采食量，影響機體健康[16-17]。在禽類動物產蛋性能方面，研究發(fā)現氟苯尼考可以導致蛋殼厚度下降，畸形蛋數量增多，種蛋受精率和孵化率下降[18-19]。本實驗也發(fā)現240 mg/（kgmb·d）劑量組在休藥期的1～3 d蛋雞產蛋率顯著低于對照組，也說明過量使用氟苯尼考對禽類動物產蛋性能有負面影響。

3.2 氟苯尼考在產蛋雞和雞蛋各部位的殘留含量

口服氟苯尼考后，氟苯尼考直接進入胃腸道，一部分吸收進入肝臟，一部分隨著血液循環(huán)到達其他部位，進入肝臟的氟苯尼考在肝藥酶的作用下代謝分解成氟苯尼考胺等代謝產物，到達腎臟的氟苯尼考則以原形式隨尿液排出[20-23]。本實驗發(fā)現在蛋雞的肝臟和肌肉組織與蛋清、蛋黃中均檢測出氟苯尼考及氟苯尼考胺，且相同時間時氟苯尼考殘留含量均高于其代謝產物氟苯尼考胺；組織中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留含量在休藥第1天達到峰值，雞蛋中殘留含量在休藥第1～3天達到峰值，然后進入快速消除期，隨后消除速度減慢，這和氟苯尼考半衰期時間吻合，研究表明在魚、雞、馬、牛體內半衰期分別為12.2、2.9、1.8、2.6 h[1]。也與Xie Kaizhou[23]、Filazi[24]等的研究結果相似。

一些研究者發(fā)現氟苯尼考及氟苯尼考胺在動物組織中氟苯尼考殘留含量從高到低的部位依次為腎臟＞肝臟＞皮脂＞肌肉，氟苯尼考胺殘留含量從高到低的部位依次為肝臟＞腎臟＞肌肉＞皮脂[25-28]。本實驗結果與上述研究大致相似。從氟苯尼考和氟苯尼考胺含量分布來看：蛋黃＞卵黃＞蛋清＞肝臟＞肌肉，雞蛋是殘留的主要部位，其中蛋黃中的殘留含量高于蛋清；從殘留消除所需休藥時間來看：肝臟＜肌肉＜蛋清＜蛋黃＜卵黃，組織中完全消除所需休藥時間更短。這和氟苯尼考及氟苯尼考胺的親脂特性密切相關，脂質含量在蛋黃和卵黃中高于蛋清，在肝臟中高于肌肉。另一方面，這可能還與雞蛋的形成過程相關。禽類在產蛋開始前，卵巢中就有很多小卵黃形成，經過8～14 d的快速生長期，小卵黃逐個成熟，第一個卵黃（即次日形成雞蛋的蛋黃）直徑可達25 mm。卵黃發(fā)育成熟后，脫離卵巢到達輸卵管膨大部，經3～4 h被蛋清包裹，再在輸卵管峽部經1～1.5 h形成蛋膜，此時即為包裹蛋膜的軟蛋，軟蛋再于輸卵管后部經18～20 h形成完整蛋殼，此時完整的雞蛋形成[29]。蛋黃中氟苯尼考的殘留消除時間為12～14 d，氟苯尼考胺的消除時間為13～15 d，這和卵黃的形成時間8～15 d吻合。雞蛋形成過程中不斷地通過血液循環(huán)快速沉積營養(yǎng)物質，而氟苯尼考半衰期較短，代謝及排泄速度快，故而氟苯尼考沉積在雞蛋中的含量高于組織中，所需休藥時間也長于組織。

GB 31650—2019[10]規(guī)定產蛋期禁用氟苯尼考。生產中一般認為產蛋率達到5%時，該群蛋雞即進入產蛋期。而層出不窮的雞蛋檢出氟苯尼考案例可能與販售產蛋前期雞蛋有關。美國食品和藥物管理局則規(guī)定禽類禁用氟苯尼考。為保障食品安全，氟苯尼考的使用和休藥可能需要進一步的研究和修訂。

3.3 殘留預測模型

目前大部分細菌對氟苯尼考仍然敏感，但長期使用會導致耐藥基因如ffexA、fexB、cfr、optrA、floR和pexA的產生[30]?？股卦陔u蛋及可食用組織的殘留嚴重影響食品質量安全，長期攝入殘留有氟苯尼考及其代謝產物的食品會使人體產生一定的耐藥性。

研究發(fā)現休藥時間、給藥劑量對各部位殘留含量有高度顯著的影響（P＜0.001），且休藥時間及給藥劑量之間的互作效應高度顯著（P＜0.001），本實驗以休藥時間、給藥劑量為自變量，殘留含量為因變量，建立了殘留消除數學模型，其中蛋黃中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留模型準確度最高，R2分別為0.846、0.838；蛋清、卵黃、肝臟殘留模型準確度低于蛋黃，R2在0.578～0.672之間；而肌肉殘留模型準確度較低，其中肌肉氟苯尼考殘留模型R2僅為0.130。這可能是因為氟苯尼考及氟苯尼考胺在雞蛋中殘留含量更為穩(wěn)定，而肌肉中的殘留含量還需更多的實驗數據支持。建立殘留預測數學模型后，可根據藥物使用劑量和休藥時間預估畜產品殘留含量，也可根據藥物使用劑量和國家規(guī)定的殘留限量倒推休藥時間，減少實際生產中的檢測成本，保障食品安全。根據模型預測，為達到《中國獸藥典（2015年版）》規(guī)定的氟苯尼考給藥劑量范圍（40～60 mg/（kgmb·d））[31]，肌肉、肝臟等組織需休藥1 d，蛋清、蛋黃需休藥13 d，卵黃需休藥21 d。

4 結 論

氟苯尼考及其代謝產物氟苯尼考胺在產蛋雞組織中殘留含量分布為蛋黃＞卵黃＞蛋清＞肝臟＞肌肉，給藥劑量與休藥時間之間存在高度顯著的互作效應，給藥劑量、休藥時間與殘留含量之間呈二元二次回歸關系。卵黃所需休藥時間最長，蛋清蛋黃次之，但均比肌肉所需休藥時間長，提示應重點關注蛋雞養(yǎng)殖過程中氟苯尼考的使用，加強禽蛋的質量監(jiān)測，保障食品安全。