王迎捷 方明 黃鸝 唐立輝 陳吉華 王疆

各類樹脂修復(fù)材料以及依靠樹脂水門汀粘接的全瓷修復(fù)體應(yīng)用日益廣泛，但大量臨床調(diào)查及研究均指出，修復(fù)體粘接強(qiáng)度不足和邊緣牙體組織繼發(fā)齲仍是目前導(dǎo)致口腔粘接修復(fù)失敗的最常見的兩個原因［1－2］。眾多學(xué)者和牙科材料廠商圍繞這兩個薄弱環(huán)節(jié)進(jìn)行了大量的研究并推出了多種功能性材料。

偶聯(lián)劑能有效地改善界面粘接強(qiáng)度，同時避免機(jī)械性表面處理造成的修復(fù)體表面結(jié)構(gòu)破壞、適合性降低等問題，在許多粘接修復(fù)的過程中使用偶聯(lián)劑已成為共識。添加季銨鹽抗菌單體的牙科修復(fù)材料，能利用其獨(dú)特的接觸殺菌效果持續(xù)殺滅存在于牙齒表面或進(jìn)入粘接界面的細(xì)菌，是目前防治齲病最有效、最直接的途徑。盡管偶聯(lián)劑和季銨鹽抗菌修復(fù)材料的應(yīng)用能顯著改善粘接效果，但口腔粘接修復(fù)步驟相對繁瑣和技術(shù)敏感性強(qiáng)的問題仍然困擾著許多臨床醫(yī)生。

針對上述情況，課題組在前期研究工作的基礎(chǔ)上，依據(jù)口腔粘接修復(fù)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出一類兼具偶聯(lián)和抗菌性能，并能夠與牙科常用甲基丙烯酸酯類樹脂單體聚合的有機(jī)硅季銨鹽多功能分子NMOAC（其分子結(jié)構(gòu)式見圖1）。本研究目的在于初步評價NMOAC的偶聯(lián)效果和抗菌活性，論證牙科有機(jī)硅季銨鹽應(yīng)用的可行性，并為進(jìn)一步分子設(shè)計(jì)和性能改進(jìn)提供參考。

圖1 甲基丙烯酸酯改性有機(jī)硅季銨鹽NMOAC的分子結(jié)構(gòu)式Fig 1 Molecular structure of a methacrylate modified organosilicon quaternary ammonium salt（NMOAC）

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

2-（甲基（十八烷基）（3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基）-λ4-氮烷基）乙基甲基丙烯酸酯氯化銨（NMOAC）、甲基丙烯酰氧基十一烷基甲基二乙氧基硅烷（DMSDIB）、甲基丙烯酰氧乙基－正十六烷基－二甲基氯化銨（DMAE-CB）、2-（甲基丙烯酞氧乙基）－正十六烷基一甲基溴化銨（MAE-HB）由空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院研制。采用菌株變形鏈球菌ATCC25175、粘性放線菌ATCC15987、金黃色葡萄球菌ATCC29213和白色念珠菌ATCC90028由空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)科提供。Porcelain Primer瓷偶聯(lián)劑、Biscem自粘接樹脂水門?。˙isco，USA）；E-max鑄瓷塊（Ivoclar Vivadent，Liechtenstein）；胎牛血清（杭州四季青）；腦心浸液培養(yǎng)基（BHI，Oxoid，UK）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 偶聯(lián)性能測試 將合成的有機(jī)硅季銨鹽NMOAC和課題組前期研制的長鏈硅烷DMSDIB溶入99%乙醇中，加入少量去離子水和乙酸，調(diào)節(jié)pH值為4，分別配制成質(zhì)量濃度為2%的兩種硅烷溶液；選取成品瓷偶聯(lián)劑Porcelain Primer作為標(biāo)準(zhǔn)對照。

將直徑15 mm、厚4 mm的圓盤狀鑄瓷基底和直徑6 mm、厚2 mm的圓盤狀鑄瓷片被粘體依次用320＃、500＃、1 000＃水砂紙磨光，超聲清洗5 min，吹干。用打孔機(jī)在聚乙烯薄膜（厚約50μm）上制備直徑2 mm的圓孔，然后將聚乙烯薄膜粘在瓷基底中央以控制粘接面積與樹脂水門汀厚度。根據(jù)不同偶聯(lián)劑分為3組，每組20個樣本。將3種偶聯(lián)劑分別涂抹在相應(yīng)實(shí)驗(yàn)組瓷基底和被粘體的粘接面，靜置60 s后吹干。將Biscem樹脂水門汀調(diào)拌后，涂抹于瓷基底表面的聚乙烯薄膜圓孔中，將同樣經(jīng)過處理的被粘體覆蓋在瓷基底上，50 g砝碼加壓粘接，去除溢出的樹脂水門汀，從各方向光照固化各40 s［3］。

剔除粘接時發(fā)生相對位移的試件，各組隨機(jī)選取16個粘接樣本進(jìn)行37℃恒溫水浴24 h，然后隨機(jī)取8個粘接試樣進(jìn)行即刻剪切強(qiáng)度測試，AGS-500萬能材料試驗(yàn)機(jī)（Shimadzu，Japan）上探頭速度設(shè)定為0.5 mm/min；每組另外8個試樣進(jìn)行5～55℃去離子水冷熱循環(huán)5 000次（1循環(huán)/min），然后進(jìn)行剪切強(qiáng)度測試。SPSS 20.0軟件（SPSS Inc.，USA）采用 one-way ANOVA及two-way ANOVA（不同偶聯(lián)劑處理、冷熱循環(huán)前后）分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果（α＝0.05）。

1.2.2 抗菌活性測試 以液體稀釋法測定有機(jī)硅季銨鹽NMOAC和課題組前期研制的兩種季銨鹽單體對4種常見口腔致病菌的抗菌活性。使用BHI液體培養(yǎng)基作為溶劑，配制成初始濃度為50 mg/mL溶液，連續(xù)倍比稀釋配制成梯度濃度倍比稀釋液各1 mL。實(shí)驗(yàn)菌株隔夜培養(yǎng)后用細(xì)菌比濁儀調(diào)整菌液濃度至1×106CFU/mL，每管含有不同濃度單體稀釋液中加入菌液10μL并迅速用渦旋混合器混勻。含變形鏈球菌、粘性放線菌培養(yǎng)管置于37℃厭氧培養(yǎng)箱；白色念珠菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)管置于37℃空氣培養(yǎng)箱。培養(yǎng)24 h后觀察試管中液體搖勻后仍清亮無混濁的抗菌劑最低濃度為最低抑菌濃度（MIC）。接種環(huán)挑取清亮試管中的培養(yǎng)物，劃線接種于BHI瓊脂平板上，孵育48 h，無細(xì)菌生長的最低抗菌單體濃度為該抗菌單體的最低殺菌濃度（MBC）。以上步驟重復(fù)3次。同時設(shè)立陽性和陰性對照，陽性對照不加抗菌單體只加入標(biāo)化的菌懸液和等量培養(yǎng)基，陰性對照為不加菌懸液和抗菌單體的培養(yǎng)基［4］。

SPSS 20.0軟件對各單體的MIC和MBC值進(jìn)行方差分析以及LSD檢驗(yàn)（α＝0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 粘接強(qiáng)度

經(jīng)不同偶聯(lián)劑處理后，瓷試件剪切粘接強(qiáng)度的結(jié)果詳見圖2。有機(jī)硅季銨鹽NMOAC處理的試件，即刻粘接強(qiáng)度與Porcelain Primer處理組、長鏈硅烷DMSDIB處理組之間無顯著差異（P＞0.05）；老化處理后各組瓷粘接強(qiáng)度均明顯降低（P＜0.05），其中NMOAC和DMSDIB處理組的老化粘接強(qiáng)度均顯著高于Porcelain Primer處理組（P＜0.05）。

圖2 不同偶聯(lián)劑處理后瓷粘接的即刻剪切強(qiáng)度與老化粘接強(qiáng)度（MPa）Fig 2 The immediate and aging shear bond strength between resin cement and porcelain treated with different coupling agents（MPa）

2.2 MIC/MBC值測定

有機(jī)硅季銨鹽NMOAC和2種季銨鹽單體對4種口腔致病菌的MIC/MBC值見表1。NMOAC對4種口腔常見致病菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性，MIC值介于6.1～24.4μg/mL之間，作用于相同菌株時 NMOAC與課題組前期研制的兩種季銨鹽單體（MAE-HB和DMAE-CB）的 MIC值之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。

表1 不同季銨鹽對4種口腔病原菌的MIC/MBC值Tab 1 MIC/MBC values of different quaternary ammonium salts against4 oral pathogenic bacterias

3 討 論

目前瓷貼面、嵌體等修復(fù)體粘接的臨床操作仍相對繁瑣，具有較強(qiáng)的技術(shù)敏感性，許多初學(xué)者往往因?yàn)椴荒芡耆莆照辰有迯?fù)的步驟和技術(shù)要點(diǎn)而導(dǎo)致最終修復(fù)效果大打折扣。有研究顯示，熟練掌握口腔粘接技術(shù)的專業(yè)人員粘接的瓷貼面能夠承受約25 MPa以上的剪切力［5］，臨床壽命甚至高達(dá) 20年以上［6］；而缺乏粘接經(jīng)驗(yàn)的牙科醫(yī)生或?qū)嵙?xí)生粘接的瓷貼面短期失敗率則高達(dá)34.48%［7］。如果有一種材料能夠同時行使硅烷偶聯(lián)劑和季銨鹽抗菌單體的功能，甚至將粘接劑的功能合而為一，那么粘接修復(fù)臨床操作的步驟也將從3～4步簡化為2步甚至是1步，既方便初學(xué)者掌握，又能降低操作失誤的概率，對于口腔粘接修復(fù)技術(shù)的進(jìn)一步推廣具有重大意義。

查閱文獻(xiàn)后，作者發(fā)現(xiàn)紡織品表面抗菌劑有機(jī)硅季銨鹽DC-5700結(jié)構(gòu)中同時具備硅氧烷基團(tuán)和陽離子季銨基團(tuán)這兩種特征官能團(tuán)［8］，與牙科材料中使用的硅烷偶聯(lián)劑和季銨鹽抗菌單體有類似之處，但缺乏能與牙科常用樹脂單體共聚的甲基丙烯酸酯基團(tuán)。課題組嘗試進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，以18烷基溴、2-（甲氨基）乙醇等為起始原料，通過親核加成反應(yīng)、酯化反應(yīng)和季銨化反應(yīng)三個核心環(huán)節(jié)，最終獲得甲基丙烯酸酯改性有機(jī)硅季銨鹽NMOAC。經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定，證實(shí)這種分子同時具備硅氧烷基團(tuán)、陽離子季銨基團(tuán)和甲基丙烯酸酯基團(tuán)（其MS鑒定譜見圖3）。本研究的目的在于驗(yàn)證改性的有機(jī)硅季銨鹽NMOAC是否能正常行使偶聯(lián)劑和季銨鹽抗菌劑的功能。

圖3 有機(jī)硅季銨鹽NMOAC的結(jié)構(gòu)鑒定譜（MS）Fig 3 Structure identification spectrum（MS）of NMOAC

作為偶聯(lián)劑使用時，即刻粘接強(qiáng)度測試結(jié)果顯示有機(jī)硅季銨鹽NMOAC溶液處理后的瓷粘接強(qiáng)度與商品偶聯(lián)劑Porcelain Primer以及課題組前期合成的長鏈硅烷DMSDIB效果相當(dāng)，說明NMOAC分子中的硅氧烷基團(tuán)能夠正常水解并與瓷表面的羥基等結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)，甲基丙烯酸酯基團(tuán)或疏水碳鏈能與樹脂單體相結(jié)合，正常行使偶聯(lián)功能，促進(jìn)粘接強(qiáng)度提高。尤其值得注意的是，老化處理后NMOAC和DMSDIB處理組的瓷粘接強(qiáng)度均顯著高于Porcelain Primer處理組P（P＜0.05）。推測這是由于課題組合成的NMOAC分子與DMSDIB分子的碳鏈長度均比牙科常用硅烷分子γ-MPS長，根據(jù)變形層理論，硅烷偶聯(lián)劑分子長度在一定范圍內(nèi)增加時能形成模量遞減的拘束層，可以緩和界面應(yīng)力［9］，拉緊界面上粘接劑的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到增韌的效果，這與課題組前期研究結(jié)果相符［10］。

抗菌活性測試結(jié)果顯示甲基丙烯酸酯改性有機(jī)硅季銨鹽NMOAC對4種口腔常見致病菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性。季銨鹽類抗菌單體的抗菌性能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，其中季銨基團(tuán)中疏水碳鏈長度的影響最為顯著［11］。細(xì)菌細(xì)胞膜系統(tǒng)中磷脂的疏水端碳鏈長度為17左右，所以當(dāng)季銨鹽單體N端攜帶碳鏈長度在17左右時，由于其結(jié)構(gòu)和磷脂相似，疏水尾更容易插入細(xì)胞膜，破壞細(xì)胞膜穩(wěn)定性，造成菌體死亡。本研究中用于對照的兩種季銨鹽單體MAE-HB和DMAE-CB的疏水碳鏈長度分別為C17和C16，而有機(jī)硅季銨鹽NMOAC的疏水碳鏈長度為C18，三者發(fā)揮抗菌作用的疏水碳鏈長度接近，因而表現(xiàn)出相似的抗菌活性。研究結(jié)果同時也證實(shí)，NMOAC中親水的硅氧烷基團(tuán)并未影響到N端疏水碳鏈的抗菌效能。

本研究驗(yàn)證了NMOAC分子的偶聯(lián)效能和抗菌活性，初步證實(shí)了甲基丙烯酸酯改性的有機(jī)硅季銨鹽用于牙科材料領(lǐng)域的可行性，為粘接修復(fù)臨床操作步驟的簡化提供了可能，關(guān)于其交聯(lián)性能和長期穩(wěn)定性仍有待進(jìn)一步研究。