張丹妮，段霞光，郝春光，支小軍，朱海峰，黃再青

（內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院麻醉科，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

腸鏡檢查是臨床中腸道疾病的常規(guī)檢查，但普通腸鏡作為一種侵入性的臨床操作，操作時間長，可刺激腸道反射性痙攣，導(dǎo)致諸多不良反應(yīng)如腹部脹痛、惡心嘔吐等[1-2]。無痛腸鏡檢測通過進(jìn)行適當(dāng)?shù)逆?zhèn)靜、鎮(zhèn)痛，可有效減少疼痛與不適，進(jìn)而減輕應(yīng)激性損傷，同時也提供良好的操作條件，有助于更仔細(xì)、徹底地完成檢查和治療[3-4]。作為常用于侵入性操作的麻醉性鎮(zhèn)靜藥物，丙泊酚起效快，蘇醒質(zhì)量高，在體內(nèi)無蓄積，但存在鎮(zhèn)痛效果弱，對呼吸循環(huán)系統(tǒng)有明顯抑制作用的缺點，因此常復(fù)合應(yīng)用鎮(zhèn)痛藥[5-8]。本文旨在研究氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚用于無痛腸鏡檢查的麻醉效果，并初步探討氫嗎啡酮產(chǎn)生內(nèi)臟痛鎮(zhèn)痛作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 模型制備

清潔級雄性SD大鼠（體重 295～360 g）購自昆明醫(yī)科大學(xué)動物研究中心（動物許可證號SCXK（滇）k2015-0002），動物飼養(yǎng)室的室溫20 ℃～24 ℃，相對濕度55%～65%，自由攝食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實驗。實驗前禁食24 h。將大鼠通過隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分成4組：正常組（n=12）：腹腔注射0.9% 生理鹽水，丙泊酚組（n=12）：腹腔注射丙泊酚30 mg/kg；芬太尼復(fù)合丙泊酚組（n=12）：腹腔注射芬太尼50 μg/kg+丙泊酚30 mg/kg；氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚組（n=12）：腹腔注射氫嗎啡酮0.2 mg+丙泊酚30 mg/kg。正常組不做特殊處理，其余大鼠麻醉10 min后，將涂以石蠟油，充分潤滑的氣囊經(jīng)大鼠肛門緩慢插入至直腸內(nèi)6～7 cm，用醫(yī)用膠帶固定體外導(dǎo)管，緩慢注氣至60 mmHg，分別進(jìn)行1次/5 min，每次持續(xù)30 s的結(jié)直腸擴(kuò)張。

1.2 行為反應(yīng)評分

將大鼠放入無蓋的有機(jī)玻璃箱中（20 cm ×15 cm ×15 cm），觀察每次注氣時大鼠的行為反應(yīng)，按照腹壁撤回反射（AWR3）評分標(biāo)準(zhǔn)（0分，大鼠無明顯行為變化；1分，大鼠身體不動或僅有簡單的頭部運(yùn)動；2分，大鼠腹部肌肉開始收縮；3分，大鼠下腹壁抬離箱底或明顯收縮變平；4分，大鼠腹壁拱起或伴身體、骨盆躬起），在注藥后10，15，20，25 min 4個時間點對腹壁撤回反射的強(qiáng)度進(jìn)行評分[9]。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

各組大鼠予以腹主動脈采血，所取樣本靜置后離心取上清液，-80 ℃冰箱保存。參照腎上腺素（epinephrine，E）試劑盒以及去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）試劑盒（均購于武漢默沙克）的操作指南進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實驗測定血清中腎上腺素以及去甲腎上腺素的濃度。

1.4 Western blot

取適量脊髓樣本加入組織裂解液提取總蛋白，根據(jù)試劑盒說明使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，脫脂奶粉室溫封閉后，加入一抗p38（1∶1 000），p-p38（1∶1 000）（均購于abcam公司）4 ℃過夜，后加入二抗（1∶2 000）室溫下孵育2 h。ECL法顯影，β-actin為內(nèi)參，目的蛋白與β-actin蛋白灰度比為相對蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料服從正態(tài)分布，并通過GraphPad Prism 9.0 軟件（graphpad software，san diego，CA）進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)表達(dá)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，如有差異進(jìn)一步用Tukey's Multiple Comparison Test進(jìn)行兩兩比較。在圖中以連線表示比較的組別，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為反應(yīng)

腹腔注射給藥10 min后，丙泊酚組的腹壁撤回反射（AWR3）評分?jǐn)?shù)值明顯高于芬太尼復(fù)合丙泊酚組以及氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚組（P＜0.000 1），而芬太尼復(fù)合丙泊酚組以及氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚組之間的AWR3評分?jǐn)?shù)值差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3組均在腹部給藥15 min后到達(dá)AWR3評分?jǐn)?shù)值最低點，證明鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛效果在腹部給藥15 min后最佳。隨后，腹部給藥20 min后，丙泊酚組的AWR3評分?jǐn)?shù)值開始上升，證明丙泊酚組的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛效果開始減弱，而芬太尼復(fù)合丙泊酚組以及氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚組的AWR3評分?jǐn)?shù)值與給藥10～15 min時相比雖有上升，但仍維持在較低水平，證明丙泊酚復(fù)合鎮(zhèn)痛藥氫嗎啡酮或芬太尼后，對結(jié)直腸擴(kuò)張模型的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛時效有明顯的提高，見圖1。

圖1 大鼠腹壁撤回反射（AWR3）評分Fig.1 Abdominal withdrawal reflex（AWR3）score

2.2 各組腎上腺素，去甲腎上腺素的含量

ELISA檢測結(jié)果顯示，與正常組大鼠比較，丙泊酚組大鼠血清中腎上腺素（E）（P＜0.000 1），去甲腎上腺素（NE）（P＜0.000 1）的含量均有明顯上升，而芬太尼復(fù)合丙泊酚組以及氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚組的腎上腺素，去甲腎上腺素的含量與丙泊酚組大鼠相比均有明顯降低（腎上腺素：P=0.002 3，P=0.000 2；去甲腎上腺素：P＜0.000 1，P＜0.000 1），且2組之間差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 腎上腺素，去甲腎上腺素濃度檢測Fig.2 Determination of epinephrine and norepinephrine.

2.3 各組MAPK p38表達(dá)變化

WB檢測結(jié)果顯示，與正常組大鼠比較，丙泊酚組大鼠血清中p-p38/p38比值有明顯上升（P＜0.000 1），而芬太尼復(fù)合丙泊酚組以及氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚組的p-p38/p38比值與丙泊酚組大鼠相比均有明顯降低（P＜0.000 1＞），且2組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 MAPK p38表達(dá)變化Fig.3 Expression of MAPK p38

3 討論

由于現(xiàn)代社會的生活壓力劇增，人們的飲食水平改變，腸道疾病頻發(fā)[10]，而腸鏡檢查作為消化內(nèi)科的常規(guī)診斷和治療手段，可以直接觀察到腸道粘膜顏色，病變的部位以及性質(zhì)，同時還能進(jìn)行活檢和微創(chuàng)手術(shù)治療[11-12]。然而，由于腸鏡檢查過程會對腸道及腸系膜造成牽拉刺激，產(chǎn)生牽涉痛以及神經(jīng)性痙攣，而對結(jié)直腸的刺激導(dǎo)致交感神經(jīng)過度興奮，造成惡心、嘔吐、嗆咳、呃逆、躁動不安、竇性心動過速及高血壓等應(yīng)激反應(yīng)[13-14]。接受無痛腸鏡時患者處于淺麻醉狀態(tài)，既要保證在腸鏡檢查過程中充分鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛，又要保證麻醉后能迅速恢復(fù)，且應(yīng)考慮有效降低術(shù)中以及術(shù)后的麻醉風(fēng)險[15-16]。丙泊酚是一種烷基酸類短效靜脈麻醉藥物，廣泛應(yīng)用于臨床短小手術(shù)和操作的麻醉與鎮(zhèn)靜[17-18]。丙泊酚具有起效快，麻醉平穩(wěn)，蘇醒完全等特點，但由于其鎮(zhèn)痛作用弱，單獨使用時所需劑量較大，可能造成呼吸抑制和呼吸暫停及循環(huán)暫停，故臨床上常需復(fù)合應(yīng)用鎮(zhèn)痛藥[19-21]。芬太尼是常用的阿片類藥，但其呼吸抑制明顯，常導(dǎo)致缺氧甚至窒息等麻醉風(fēng)險[22-23]。本文主要驗證了氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚對大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用，以及氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚對MAPK通路的抑制作用。

氫酮嗎啡是一種半合成阿片類鎮(zhèn)痛藥，主要作用于阿片μ受體，較少作用在δ受體[24-25]。其鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)，是嗎啡的5～8倍，且麻醉起效快，主要代謝產(chǎn)物無活性，不良反應(yīng)相比嗎啡較少，臨床應(yīng)用安全有效[26-27]。然而，目前仍缺乏關(guān)于氫嗎啡酮是否適合用于無痛腸鏡檢查麻醉的報道。應(yīng)激反應(yīng)是評價麻醉效果的重要指標(biāo)，有研究表明，進(jìn)行無痛腸鏡檢查時，患者處于應(yīng)激狀態(tài)下，腎上腺素，去甲腎上腺素水平不斷上升[17,28]。本文實驗結(jié)果證明，給予氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚，可以很大程度緩解結(jié)直腸擴(kuò)張模型內(nèi)臟痛，且緩解程度與芬太尼復(fù)合丙泊酚的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛效果類似。

目前研究認(rèn)為，絲裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinase，MAPKs）主要包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signalregulated kinase，ERK1/2）、氨基末端激酶（jun nlerminal kinase，JNK）、p38 MAPK 和ERK5[29-30]。MAPKs 家族成員之間對信號途徑的接受和轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，有其共性，也存在特異性之處。其中，p38MAPK主要接收上游MAPK 激酶（MAPK kinase，MKK）MKK3，MKK6的激發(fā)或抑制[31]。p38MAPK為雙磷酸化三肽模體“T-G-Y“結(jié)構(gòu)，參與調(diào)控細(xì)胞炎癥，應(yīng)激，凋亡[32-33]。p38參與疼痛的調(diào)控，包括外周和中樞敏化。據(jù)報道，p38MAPK信號通路參與術(shù)后疼痛的發(fā)生和維持，當(dāng)疼痛發(fā)生時，p38信號通路被激活，p38MAPK磷酸化增加，大鼠痛閾降低，疼痛敏感[34]。當(dāng)給予氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚，結(jié)直腸擴(kuò)張模型大鼠脊髓中的p38MAPK磷酸化明顯下降，證明氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚能有效抑制p38MAPK 的磷酸化，從而緩解疼痛，且緩解機(jī)制可能與芬太尼復(fù)合丙泊酚的鎮(zhèn)痛機(jī)制類似。

目前認(rèn)為，p38主要通過多種疼痛介質(zhì)參與中樞敏化的調(diào)控，如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、腫瘤壞死因-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interleukin1β，IL-1β）和環(huán)氧化酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2）等[30]。有研究表明，IL-1可通過激活神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞中的MAPK信號通路導(dǎo)致中樞敏化[35]。因此，氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚如何影響p38MAPK上游疼痛介質(zhì)的表達(dá)還有待進(jìn)一步驗證。

總之，本文首次對氫酮嗎啡用于擴(kuò)張內(nèi)臟痛的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛效果進(jìn)行了評估，并對其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。本文證明，氫嗎啡酮復(fù)合丙泊酚能可有效抑制p38MAPK 的磷酸化，因此可以在擴(kuò)張性結(jié)直腸模型中很大程度緩解結(jié)內(nèi)臟痛，且其對擴(kuò)張內(nèi)臟痛的緩解程度及其機(jī)制與氫酮嗎啡復(fù)合丙泊酚類似，表明氫酮嗎啡或可代替芬太尼用于臨床無痛腸鏡的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛，對無痛腸鏡檢查的麻醉藥物選擇具有一定的臨床指導(dǎo)意義。