雒向?qū)?王文娟,李 凱,杜宏宏

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科(咸陽(yáng)712000);2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)中心(咸陽(yáng)712000)

前列腺癌是最常見(jiàn)的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，多見(jiàn)于60歲以上的老年男性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)男性人群中大約有15%會(huì)發(fā)生前列腺癌[1]。近10年以來(lái)，我國(guó)的前列腺癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)。前列腺癌包括雄激素依賴型(Androgen dependent prostate cancer，ADPC)和雄激素非依賴型(Androgen independent prostate cancer，AIPC)。絕大多數(shù)前列腺癌患者起初為ADPC，即對(duì)抑制雄激素的內(nèi)分泌藥物治療敏感有效。然而，經(jīng)抑制雄激素的內(nèi)分泌治療平均2.5年后，上述患者均將轉(zhuǎn)化為AIPC，即對(duì)抑制雄激素的內(nèi)分泌治療無(wú)反應(yīng)。后者病情進(jìn)展迅速，生存期一般不超過(guò)18個(gè)月。因此，AIPC的替代治療藥物研發(fā)成為研究熱點(diǎn)。去甲斑蝥素是從動(dòng)物類藥物斑蝥蟲(chóng)體內(nèi)提取斑蝥素的去甲基化類似物。現(xiàn)有研究顯示，去甲斑蝥素具有強(qiáng)大的抗癌活性，目前已應(yīng)用于多種惡性腫瘤的臨床治療。本次實(shí)驗(yàn)重在研究去甲斑蝥素是否具有抑制AIPC細(xì)胞PC-3增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 PC-3細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞所國(guó)家細(xì)胞庫(kù)；去甲斑蝥素購(gòu)自Aladdin公司，CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beyotime公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司，熒光倒置顯微鏡(日本，OLYMPUS)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本，SANYO)，酶標(biāo)儀(美國(guó)，Thermo)。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：將解凍復(fù)蘇后的PC-3細(xì)胞接種在含有 10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)液中，在37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，飽和濕度條件下培養(yǎng)。②細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)：參照CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒步驟說(shuō)明，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC-3細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到5×103個(gè)/100 μl，接入96孔板，每孔100 μl細(xì)胞懸液，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，加入100 μl不同濃度培養(yǎng)液配制的去甲斑蝥素，使最終濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml，每組3個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束以后，每孔加入10 μl CCK-8，37 ℃培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值。③細(xì)胞周期和凋亡率測(cè)定：按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞，加入不同濃度的含去甲斑蝥素培養(yǎng)液，使去甲斑蝥素最終濃度分別為12.5、25.0、50.0 μg/ml，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組，37 ℃分別培養(yǎng)48 h。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

結(jié) 果

1 去甲斑蝥素對(duì)PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 空白對(duì)照組、12.5、25.0、50.0 μg/ml的去甲斑蝥素作用于PC-3細(xì)胞，作用48 h后，PC-3細(xì)胞受到不同程度地抑制，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。去甲斑蝥素濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml時(shí)的抑制率分別為(22.16±4.26)%、(46.71±0.98)%、(52.54 ±3.48)%，隨著去甲斑蝥素藥物濃度的增加，對(duì)PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果越加增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的量-效關(guān)系，與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IC50為45.87 μg/ml。

2 去甲斑蝥素對(duì)PC-3細(xì)胞周期的影響 去甲斑蝥素作用PC-3細(xì)胞48 h后，可使PC-3細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞顯著減少，S、G2期PC-3細(xì)胞增加，且作用隨著去甲斑蝥素的濃度增加呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表1、圖1。

A：空白對(duì)照組；B：12.5 μg/ml 去甲斑蝥素組；C：25.0 μg/ml 去甲斑蝥素組；D：50.0 μg/ml 去甲斑蝥素組

表1 不同濃度去甲斑蝥素對(duì)PC-3細(xì)胞周期的影響

3 去甲斑蝥素對(duì)PC-3凋亡率的影響 流式細(xì)胞法測(cè)定三種去甲斑蝥素濃度劑量作用于PC-3細(xì)胞48 h后的凋亡率，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且作用隨著去甲斑蝥素的濃度增加呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)表2。

表2 不同濃度去甲斑蝥素對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡率的影響

4 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 空白對(duì)照組、12.5、25.0、50.0 μg/ml去甲斑蝥素組分別作用于PC-3細(xì)胞48 h后：空白對(duì)照組PC-3細(xì)胞活躍生長(zhǎng)，呈上皮樣貼壁繁殖，細(xì)胞之間緊密連接。各濃度去甲斑蝥素組PC-3細(xì)胞體積均變小、變圓，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞間連接疏松，貼壁能力明顯減弱，吹打易離壁漂浮，生長(zhǎng)明顯受抑制。且生長(zhǎng)抑制率與去甲斑蝥素濃度正相關(guān)。見(jiàn)圖2。

討 論

絕大多數(shù)前列腺癌患者類型起初為雄激素依賴型，即對(duì)抑制雄激素的內(nèi)分泌藥物治療敏感有效，因此，雄激素剝脫治療(Androgen deprivation therapy，ADT) 是目前針對(duì)ADPC患者重要的治療方法。但經(jīng)過(guò)平均2.5年的治療后，上述類型的患者將進(jìn)展為雄激素非依賴型，即經(jīng)過(guò)ADT治療，由于前列腺癌細(xì)胞的雄激素受體改變等原因，導(dǎo)致患者對(duì)ADT治療失效，進(jìn)入AIPC階段，出現(xiàn)疾病進(jìn)展[2]。針對(duì)ADT治療失效的前列腺癌患者病理機(jī)制的基礎(chǔ)研究顯示，AIPC患者體內(nèi)的前列腺癌組織中，仍存在持續(xù)分泌雄激素的能力，雄激素高水平的持續(xù)表達(dá)，可以繼續(xù)活化雄激素受體，刺激患者機(jī)體前列腺癌細(xì)胞不斷增殖，使得前列腺癌病情惡化蔓延[3-4]。由此可見(jiàn)，阻斷雄激素合成或轉(zhuǎn)化，仍然是治療ADT失效的前列腺癌的關(guān)鍵機(jī)制。近年研究發(fā)現(xiàn)的CYP17，是一種阻滯機(jī)體合成雄激素的關(guān)鍵限速酶，已經(jīng)證實(shí)，CYP17廣泛存在于機(jī)體的部分內(nèi)分泌器官(如腎上腺、前列腺和睪丸組織)。而醋酸阿比特龍能夠特異性抑制CYP17的活性，能夠抑制來(lái)源于上述內(nèi)分泌器官、尤其是前列腺癌細(xì)胞的雄激素合成[5]，屬于新一代的雄激素抑制藥物，能夠有效抑制雄激素在上述組織、特別是前列腺癌組織的生物合成。最新研究結(jié)果顯示，醋酸阿比特龍可以特異性地結(jié)合CYP17酶，且親和度較高，能夠有效地減少相關(guān)內(nèi)分泌組織器官的雄激素分泌。減少自然合成來(lái)源的雄激素和前列腺癌組織內(nèi)的雄激素水平，最終達(dá)到遏制ADT治療失效的AIPC的疾病進(jìn)展。然而，基于上述醋酸阿比特龍的特殊藥理機(jī)制，患者在服用該藥物后，將不同程度地引起患者促腎上腺皮質(zhì)激素含量的升高，從而容易發(fā)生高血壓、低鉀血癥和水鈉潴留等副作用，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的肝腎毒性損害[6]。同時(shí)，醋酸阿比特龍價(jià)格較為昂貴，對(duì)患者帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，上述各種因素的存在，限制了阿比特龍的臨床應(yīng)用。

去甲斑蝥素是一種由我國(guó)最先成功提取合成的新型抗腫瘤藥物，是由動(dòng)物類中藥斑蝥蟲(chóng)體內(nèi)提純的斑蝥素的衍生物(斑蝥素去除1，2位兩個(gè)甲基)，能夠發(fā)揮強(qiáng)大的抗癌作用[7]，并且同時(shí)具有升高患者外周血白細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)首先采用CCK-8法觀察了去甲斑蝥素對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，濃度為12.5、25.0、50.0 μg/ml的去甲斑蝥素作用PC-3細(xì)胞48 h，均可顯著抑制人前列腺癌細(xì)胞PC-3的細(xì)胞生長(zhǎng)，且呈濃度依賴性。其IC50值為45.87 μg/ml，說(shuō)明去甲斑蝥素可濃度依賴地抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素可使前列腺癌PC-3細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞顯著減少，S、G2期PC-3細(xì)胞增加，且作用隨著去甲斑蝥素的濃度增加呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)12.5、25.0、50.0 μg/ml濃度的去甲斑蝥素作用PC-3細(xì)胞48 h凋亡率，提示去甲斑蝥素可以明顯增加PC-3細(xì)胞的凋亡率，且與去甲斑蝥素的作用濃度正相關(guān)。通過(guò)倒置顯微鏡觀察不同濃度去甲斑蝥素作用48 h后的PC-3細(xì)胞，細(xì)胞體積均變小，細(xì)胞間連接疏松，貼壁能力明顯減弱，易離壁漂浮，生長(zhǎng)明顯受抑制，且生長(zhǎng)抑制程度與去甲斑蝥素的干預(yù)濃度正相關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明去甲斑蝥素能夠抑制PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)，可能的機(jī)制是去甲斑蝥素誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞發(fā)生凋亡并阻滯PC-3細(xì)胞的有絲分裂。

根據(jù)現(xiàn)有研究，去甲斑蝥素抗腫瘤作用機(jī)制主要包括以下5個(gè)方面。①抑制腫瘤細(xì)胞增殖：惡性細(xì)胞以有絲分裂方式“無(wú)限增殖”是產(chǎn)生人體惡性腫瘤細(xì)胞的直接原因。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素對(duì)人體多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖呈現(xiàn)出抑制效果。有國(guó)內(nèi)學(xué)者[8]研究去甲斑蝥素對(duì)體外培養(yǎng)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用，結(jié)果表明，去甲斑蝥素能有效抑制MCF-7細(xì)胞體外增殖速度，且高濃度、長(zhǎng)時(shí)間的去甲斑蝥素抑制效果更明顯，存在去甲斑蝥素作用濃度與時(shí)間的依賴性。另有學(xué)者觀察到去甲斑蝥素對(duì)體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549呈現(xiàn)顯著的抑制作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[9]，肺癌A549細(xì)胞在去甲斑蝥素作用下，大量細(xì)胞阻滯于G2/M期，同時(shí)癌細(xì)胞內(nèi)的ER-K1/2基因表達(dá)明顯降低。②促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡：正常的人體細(xì)胞，增殖和凋亡是一對(duì)同時(shí)存在的生命現(xiàn)象，兩者長(zhǎng)期處于此消彼長(zhǎng)的穩(wěn)定狀態(tài)，而惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡則打破了兩者的穩(wěn)定關(guān)系，進(jìn)入“失衡狀態(tài)”。人體惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生的重要原因之一，正是由于凋亡過(guò)程在細(xì)胞內(nèi)受到某些因素抑制，使細(xì)胞不能進(jìn)入“程序性死亡”，出現(xiàn)惡性無(wú)限增殖現(xiàn)象。有學(xué)者[10]采用不同濃度的去甲斑蝥素作用于人肝癌SMMC-7721細(xì)胞后，檢測(cè)凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去甲斑蝥素可促進(jìn)Caspase-3、Bax和細(xì)胞色素C的表達(dá)，發(fā)揮誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用，并且上述三種凋亡相關(guān)因子的表達(dá)量與去甲斑蝥素的作用濃度正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究顯示[11]，不同濃度的去甲斑蝥素處理人胃癌SGC-7901細(xì)胞后，抗凋亡蛋白因子表達(dá)減少，促凋亡蛋白因子表達(dá)則顯著增加，不同濃度去甲斑蝥素均對(duì)SGC-7901細(xì)胞產(chǎn)生促凋亡作用，使得SGC-7901細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，生長(zhǎng)周期停滯在G2/M期，且其促凋亡作用與藥物作用時(shí)間及藥物濃度呈相關(guān)性，說(shuō)明去甲斑蝥素是通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞各種抗凋亡因子與促凋亡因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。③抑制腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制：DNA復(fù)制起始蛋白是所有真核細(xì)胞啟動(dòng)DNA復(fù)制必須的調(diào)控因子，包括Cdc-6、Orc、Cdt1和Mcm2-7，其中Cdc-6蛋白屬于癌基因蛋白，可促發(fā)良性細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)變。通過(guò)抑制Cdc-6的表達(dá)，可以產(chǎn)生抗癌作用。實(shí)驗(yàn)研究顯示[12]，在去甲斑蝥素的藥物作用下，人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞、T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞以及人B淋巴細(xì)胞瘤Ramos細(xì)胞的DNA復(fù)制起始蛋白Cdc-6均被明顯降解，上述各種惡性細(xì)胞的體外生長(zhǎng)均受到抑制，并呈現(xiàn)去甲斑蝥素藥物劑量依賴性。說(shuō)明去甲斑蝥素能夠直接干擾細(xì)胞DNA的遺傳復(fù)制，實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)和擴(kuò)散的目的。④干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期：有絲分裂也是腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)方式。有研究顯示[13]，去甲斑蝥素作用于人卵巢癌SK-OV-3細(xì)胞時(shí)，可以將癌細(xì)胞大量阻滯于有絲分裂的G2/M期，使有絲分裂停滯不前。有學(xué)者[14]采用去甲斑蝥素作用于白血病K562細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素可將K562 細(xì)胞大量地阻滯于G0/ G1期，抑制有絲分裂進(jìn)程，同時(shí)具有明顯的細(xì)胞毒作用。⑤抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移：惡性腫瘤細(xì)胞有別于正常細(xì)胞和良性腫瘤細(xì)胞的主要原因是，前者能夠從原發(fā)部位經(jīng)過(guò)血液和淋巴途徑，轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的正常組織和器官，造成轉(zhuǎn)移播散進(jìn)展。內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子過(guò)度表達(dá)是刺激腫瘤滋養(yǎng)血管生成的重要因子，基質(zhì)金屬蛋白酶-2是重要的蛋白水解酶，與癌細(xì)胞突破外周組織基底膜向遠(yuǎn)處侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，已有研究證實(shí)[15]，在去甲斑蝥素作用于人膀胱癌T24細(xì)胞后，可以下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-2和內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)，降低膀胱癌的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。還有學(xué)者[16]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，去甲斑蝥素能夠顯著抑制體外培養(yǎng)的皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞的體外黏附、侵襲和遷移能力，其機(jī)制可能與其能下調(diào)內(nèi)皮血管生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶-2蛋白表達(dá)水平相關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素能夠誘導(dǎo)人雄激素非依賴型前列腺癌PC-3細(xì)胞的凋亡并干擾PC-3細(xì)胞的有絲分裂，進(jìn)而對(duì)PC-3細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，提示去甲斑蝥素或可成為治療AIPC的有效輔助藥物。去甲斑蝥素影響PC-3細(xì)胞周期并誘導(dǎo)其凋亡的詳細(xì)病理機(jī)制，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。